传统倒置相差显微镜在细胞图像采集中的运用与技术局限-上篇

       相差显微镜，即相位对比显微镜（Phase Contrast Microscope）、相衬显微镜，是基于相衬显微技术原理（Phase Contrast Microscopy, PCM）开发的可将样品透射光相位信息转换为光振幅变化以提高透明样品图像对比度的一种光学显微镜。

       荷兰物理学家Frits Zernike（弗里茨·泽尔尼克，1953年物理学诺奖获得者）在20世纪30年代发明的相衬显微技术，将倒置相差显微镜与细胞生物学实验紧紧地联系在一起。人们无需对样品进行染色处理便可直接观察活细胞形态特征、分裂和增殖的活动过程。相差显微技术诞生后，配套环形光阑、相衬物镜等光学元件的研究改进随之展开，推动了倒置相差显微镜的广泛应用，极大地促进了生命科学的发展，具有划时代的意义。

       半个多世纪以来，透射光相差分析被视为活细胞观察的基础和经典方法。相应地，透射光相差观察功能不仅是Zeiss Primovert、Leica DMiL、Nikon ECLIPSE TS2、舜宇ICX41、Motic AE2000这类基础型手动倒置相差显微镜的立命之本，相差观察模式也是Axiovert 5 Digital、Leica Mateo FL、Invitrogen EVOS FLoid数字式倒置荧光显微镜，Zeiss Axio Observer 7、Leica DMi8与Olympus IXplore Pro（IX83）等具有多路光源输入接口和图像出口的研究级多功能电动倒置荧光显微镜，BZ-X810、Invitrogen EVOS F70000、APX10等新型一体式荧光显微成像系统的基本功能选项。不仅如此，以高通量成像、3D细胞图像渲染和多维度高内涵图像分析为核心任务的宽场式高内涵、共聚焦式高内涵分析系统，如ImageXpress Micro Confocal、ImageXpress Confocal HT.ai、Operetta CLS与Opera Phenix Plus，也可视实验需要选配相差成像模块，实现细胞相差、荧光相结合的多模式图像叠加处理与分析。                                              

       倒置相差显微镜的功能设计和光路结构相对简单，既是新型相差技术引入应用的先导平台，同时也成为我们观察活细胞相差观察技术改良演变的微视场。而回顾经典相衬显微技术原理和实施要素，有助于更好地理解、探讨当前相衬技术方法上创新尝试及其理论渊源。

一、相差显微技术的基本构成要素

       光波在穿过非真空介质时会产生振幅（即强度）和相位的变化。振幅变化通常是由于介质对光的吸收，变化程度与波长（光的颜色）有关。

       人眼或光电传感器能感知的是光波振幅和颜色的变化。物理学上将引起光波振幅变化的样本或结构称为振幅体（amplitude objects）。染色的标本等振幅体内部不同结构和区域光密度不一，光透射率不同，则透射光会出现强度和颜色的差异，从而为人眼所感知。

       而培养的哺乳动物细胞、原生动物、细菌、精子的尾等细胞或结构完全透明。入射光与透射光间的强度变化微弱。此情况下采集的图像上，细胞与培养基、细胞内部细胞器间，明暗反差过小，难以清晰、完整地表征细胞的外形和内部细节特征。

       然而，无论样品是否完全透明, 因内部构造、组成成份、密度和折射率的不均衡，造成入射光的衍射、折射等传播路径改变和光程的不同。而光程变化使光波相位的不一致，既光产生了相移（phase shift）。这类在光线穿过时引起相移的标本或结构称为相位体（phase object)。相位体与透射光相互作用造成的光相位差异，为光波干涉的发生提供了基础条件。

       光若毫无遮拦地前行穿透相位体薄层，则最终以接近直射的方式从样品中射出。这部分光统称为直射光（Direct light、surround light）或参考背景光。如光线在穿越样品层中遇到样品中细微差异性结构（如细胞膜、细胞器等）干扰，发生衍射和散射，则统称为衍射光（Diffracted light）。显然，衍射光携带有与样品内部结构差异有关的光相位信息。

       相衬显微技术是根据惠更斯—菲涅耳原理，将非均一结构与属性相位体透射光中天然的衍射光和直射光分别提取，对光波振幅和(或)相位进行必要调制处理后重新复合，利用光干涉原理将光波的相位差异以光的明暗方式予以呈现。同时，利用相位与复合光波振幅二者的线性关系，将光波相干叠加形成的明暗分布与样品内部结构属性联系起来而创建图像分析方法。这种基于透射光相位调制的成像方法称为相衬对比法或相差法(Phase Contrast)。该技术是涵盖从指导理论到实施方法的一套完整体系。它无需染色处理即可将透明样品在镜下展现出反差足够、错落有致的明暗分布，实现相位体内部结构信息的可视化。

       F. Zernike的相差显微技术的相差显微技术的核心要素主要包括以下三个方面。

1、环形光阑（Annular diaphragm）

       环状光阑是安装于聚光器上透射光源与聚光镜之间的聚光镜转盘（Condenser Disk）或相衬滑块（Phase Slider or Light-Ring Slide）中圆盘状照明调节元件。照明光线从盘面的透明圆环区射入后，聚光镜将圆环形照明光焦聚投射到样本上形成一实心光斑。与暗视野（Dark-Field, DF）观察法的相同之处在于：照明光的大部分被环形光阑阻挡，仅允许透明圆环区的少量光线以小角度斜射在样品上。不同点是相衬法需保留照明光源并用作参考光。照明光大致沿原入射方向（忽略在样品薄层中光传播方向因折射造成的轻微平移）穿透样品直达物镜，并被重新校正为平行光束抵达物镜相位板的共轭区。一小部分照明光线与样品中光学致密结构（例如质膜、细胞器等）相遇而发生衍射，产生约1/4λ的相移。

2、相位板（annular phase plate）

       相位板为相差物镜专属，固定安装在物镜后焦平面上，是相衬观察的核心光学元件。

       F. Zernike的研究发现：将样品衍射光与穿透样品未发生衍射的参考光（直射光）相结合并发生相干作用方可观察到样品透射光振幅的差异；将参考光波相位提前1/4λ，使参考光与衍射光之间的的相位差增加至1/2λ时，产生相消干涉，可实现相干叠加波幅的最大化，相位体图像的对比度最优；因直射光强度远大于衍射光的强度，须将直射光强度削弱到接近于衍射光的强度后，才会观察到显著明暗反差对比。

       直射光的相位调制和光强度削减，被视为相衬显微技术所的两个基本规则。而相位板正是据此原理设计的。

       相位板为圆盘式，采用了2个无色补偿区（Complementary Area）夹1个深色环状共扼区(Conjugate Area)的同心圆布局。

       共扼区：又称相位环(Phase Ring)，为相位板上与环状光阑对应的深色圆环。表面镀有光吸收薄膜（故外观看颜色较深），可吸收大部分参考光，使参考光波振幅衰减至与衍射光振幅相当。此外，共轭区还镀有相位膜，使参考光通过时相位提前1/4λ（共轭环区厚度薄于补偿区）或延迟3/4λ（共轭环区厚度厚于补偿区）。使得衍射光与参考光之间相位差达1/2λ而发生相消干涉，增强光波相干叠加振幅和相衬对比效果。

       补偿区：相位板盘面共扼面之外的无色透明区域，用于透射来自样品的衍射光。衍射光传播方向呈360°发散状态，为尽量多地收集衍射光以增强叠加波幅，故盘面的大部分面积都用作补偿区。表面镀膜易造成衍射光的损失，多数相位板为补偿区无深色吸光介质设计，外观光洁透明。

(待续：3、环形光阑-相位板共轭)