倒置显微镜细胞图像采集中透射滤光片的合理使用

        使用倒置显微镜在相差成像模式下对未染色活细胞的观察与图像采集是细胞培养实验中的基本操作。

        倒置显微镜的透射光照明光源(transmitted-light illumination或dia-illumination)，不管是配置LED冷光源的Olympus CKX53、Leica DMi1、DM IL LED，还是配备卤素灯照明的麦克奥迪AE2000倒置相差显微镜，透射光路上光源与聚光镜之间设有滤光片架（Filter Slot, Filter Holder或Filter magazine），用于安装透射光滤光片（transmitted light filter）。不同机型适用的滤光片直径大小、可容纳滤光片数量不等。此外，不同个案随机提供的滤镜功能类型和数量有别。而论文发表编审环节对细胞图片质量并无特定要求。因此，在实际细胞成像操作中，透射光滤光片的运用容易被忽视。

        虽然透射滤光片售价不过区区数百元，对显微镜整体造价的影响甚微，但确是倒置相差显微镜系统配置时须慎重斟酌的可选元件。此外，明场、相差、DIC和霍夫曼浮雕相衬观察模式下对光路中光学元件检查调整操作，常视作显微镜成像设置的标准步骤载入厂商操作指南。

        本文尝试对细胞明场成像常用的透射光滤光片作一总结，以飨读者。

一、倒置显微镜常用透射光路滤光片的功能类型

1.1 中性密度滤光片（Neutral Density Filter, ND）

        中性密度滤光片，也叫灰色滤光片（Grey filter）、中灰滤镜、中性衰减片等，简称ND镜。它采用特殊吸光材料制成，对波长400～700nm范围的可见光亮度具有均衡、中性无差别的衰减作用，而对入射光色温（color temperature）影响小，故称为中性密度滤光片。

        光密度（Optical density, OD）常用来代表光通过透明介质时的衰减程度（介质的对光的吸收程度）。入射光强度一定时，介质吸收光强度大，则透射光强度小。用透光率（T%）来表示光线透过介质的能力。

        根据镜片材料OD值的不同，不同光密度ND镜用“N+数字”的方式标示其，N后面数字代表镜片OD值。透光率(T%)与OD值间的换算关系为T%=100/N。

        以N16滤镜为例，它代表穿透镜片的透射光强度减少到入射光强度的100/16 = 6.25%。

        培养细胞图像采集中使用的光吸收式ND镜常用规格有：

        ND2：透光率50%（透射光亮度减至入射光之1/2）；

        ND4：透光率25%（透射光亮度减至入射光之1/4）；

        ND8：透光率12.5%（透射光亮度减至入射光之1/8）；

        ND16：透光率6.3%（透射光亮度减至入射光之1/16）。

        ND后面的数字越大，减光能力越强，同等曝光设置条件下所采集的图像越暗。如要提高镜下视场亮度，应选用N后数值较小的ND镜。不同光密度类型的ND镜既可以单独使用，也可以多片ND镜组合使用，使得对视场照明亮度的调控精细化。

        在细胞相差观察中，当照明光源的亮度、视场光阑（Field diaphragm）、聚光镜头的孔径光阑（Aperture diaphragm）保持一致，则同一视野样品的透射光强度在用不同放大倍率物镜观察时是不变的。从低倍镜切换到高倍镜观察时，高倍物镜数值孔径（Numerical Aperture, NA）大于，故高倍物镜的光通量大，获得的图像更亮。

        虽然调节光源的亮度固然可调整视野明暗，但光源亮度调整的同时，往往容易造成光源色温变化。这一点在卤素灯透射光源中表现得尤为明显。

        而调整聚光镜孔径光阑也能减少视场通光量，但图像细微结构分辨能力会因此而受损。

        此时，将数字较高的ND镜转入光路来降低视场亮度，可替代对显微镜照明亮度控制按钮的调节，有利于维持不同倍率物镜下图像亮度趋于稳定、图像反差对比，保持图像拍摄条件和图像质量的可再现性。

        用ND滤镜调整透射照明光亮度，操作简便且便于统一，又不影响光源色温及图像分辨率，因此是细胞倒置成像操作中亮度调节的首选方案。蔡司Axio Observer 7、Axiovert 5、Primovert 显微镜的Grey filter 0.25与Grey filter 0.06，Olympus CKX53、Olympus IXplore Standard（IX73）及Olympus IXplore Pro （IX83）显微镜的45-ND6、45-ND25都属于ND滤镜。

1.2 色温转换滤光片（Colour Temperature Conversion Filter）

        色温即光源的颜色。用于衡量光源色彩的尺度是基于19世纪末英国物理学家开尔文勋爵（Lord Kelvin）的“黑体”（black body）热力学-光转换理论建立的。“黑体”受热后会呈现不同颜色。随着温度由低到高，“黑体”依次向外辐射黑-红-黄-白-蓝的可见光。按这一原理，任何可见光的颜色皆可对应于“黑体”在某个温度辐射光的颜色。蓝光对应于“黑体”高温，而红光与“黑体”较低温度相对应。因此，可用热黑体辐射相同颜色可见光时的热力温度值来代表光源的色温。色温的计量单位为开尔文(Kelvin, K)。例如，暖白色白炽灯光色温约为2700K，普通日光灯光色温约为6000K，而正午阳光的色温约5000K。

部分倒置显微镜型号透射光源色温

        倒置相差显微镜数码相机所采集的透射光颜色是透射光源、培养基和细胞综合作用形成的。不同实验室、不同批次样品所获得的细胞相差图像色温差别很大。暖色调透射光环境下细胞图像色调整体偏黄，而冷色调透射光下采集的图像偏蓝。

        既要确保用于发表的细胞图像资料真实准确和可重复性，又要改善细胞图像的对比度和内部结构细节的有效呈现，提高发表图片质量，利用色温转换滤光片对细胞样品透射光源进行色温调整是细胞图像采集过程中行之有效的常规操作方法。

        用色温校正滤光片调整光源色温遵守的是光色互补原理：采用对红色和绿色通道增强，对蓝光减弱提高图像黄色占比，达到暖色效果；反之，增强光源中的蓝光或同时减少红绿光，即可降低色温。

        用于调整光源的色温滤光片有降色温滤光片、升色温滤光片两大类。降低光源色温的滤光片为琥珀色（橙色）系滤光片。升色温滤光片为蓝色系滤光片。随滤光片颜色深浅程度不同，对光源色温降低幅度有所不同：颜色深，降色温作用明显；颜色浅降色温效应小。

Leica DM IL LED倒置荧光显微镜可选色温转换滤镜表

        蔡司Axio Observer 7、Axiovert 5倒置荧光显微镜的Conversion filter（5700–3200K, d=32 mm）色温转换滤光片用于将5700K色温的LED光源转换为色温3200K卤素灯光。

1.3 对比度增强滤镜（Contrast enhancement）

        对比度是指一幅图像最明亮区域和最阴暗区域间亮度层级的差别程度，即图像中亮和暗之间灰度反差的大小。

        较低的对比度，图像明暗区域间的过渡平滑柔和，明暗区带间界限模糊，图像整体缺乏层次感。高对比度图像中的亮度差异强烈，明暗区域的界限清晰，目标轮廓突出，出立体层次感明显。但容易造成细节损失、高光区域过度曝光产生光晕或局部区域曝光不足，图像质量下降。

        采用阈值设定、边缘检测和形态学检测细胞的方法用于细胞图像自动化分析中，细胞分割是基础。细胞相差图像中，只有分析对象与背景有足够的对比度，分析软件才可以在图像中识别和检测到分析目标。若细胞图像中细胞与背景的灰度级有较强重叠，差异极小。一般的阈值类方法难以从背景中分割出细胞，影响图像分析中细胞计数、细胞形态、细胞融合度等检测数据准确性。

        倒置相差显微镜增强图像对比度的方法是引入图像对比度增强滤光片。

        对比度滤光片，又称反差滤镜，是黑白摄影（如未染色细胞相差图像采集）中改变被摄景物的色调以提高对比的滤光镜。其运用方法为：提高光源中某种色彩的比例，使该色光线增强，在图像中的灰度值上升，色泽变浅（变白）；相反，如要降低色彩灰度值，使之在图像中色泽加深（变暗），则采用对该色光有吸收滤过作用的滤光片，削弱该色彩的光线。要使某色种色彩在图像上的色调变浅时（信号降低，图像灰度值降低），用允许该色光通过的滤光片；反之，若要使某种色彩在图像上的色调加深，则使用可滤除该色光的滤光片。有多种长通、短通、带通滤光片可用于色彩增强，提高图像对比度。譬如，黄色滤光片可滤除蓝、紫色，允许黄色光及红、橙、绿色光通过。蓝色滤光片滤除红橙黄绿色，允许波长较短的蓝光通过。

        倒置显微镜下的细胞相差图像是基于穿透细胞的直射光与细胞衍射光间干涉原理形成的。常用的对比滤光片是绿色干涉滤光片(Green interference filter , GIF) 。这种滤光片能有效地过滤掉照明光源中的红、橙、蓝、紫色，运行绿色和黄光通过，可以有效地增强光源中黄绿色光，削弱蓝光，提高LED照明光源的色温，提高图像黑白对比度。透射光源以蓝绿光为主，相差干涉图像锐利，细胞的细节特征呈现更清晰，故特别适适合无标活细胞的观察及拍照。Leica DMi1倒置相差显微镜的Green filter （11526125），Olympus CKX53/IXplore Standard/ IXplore Pro 的550nm Green Interference Filter（43IF550W45）皆属于对比度增强型滤光片。

        此外，黄绿色滤光片、黄色滤光片具有增强培养细胞图像对比度的功能。Leica DMi1 Yellow filter（11526126）就属于这一功能类型。

二、其它倒置显微镜透射光照明滤光片

2.1 照明漫射滤光片（Frost Diffusion Filter）

        显微镜视场照明光分布不均，造成的细胞相差图像亮度不均衡，会对图像分析过程中细胞的识别、粘连细胞的分割、形态学检测和细胞准确计数产生干扰。

        漫射滤光片由内含光散射物质的玻璃制成，其透射光比毛玻璃更均匀，可为样品提供更均匀、柔照明效果。Olympus IXplore Standard（IX73）、IXplore Pro（IX83）显微镜的45mm Frosted Diffusion Filter等即属于此类用途的滤光片。

2.2 白平衡（White Balance）调整滤镜

        不同细胞、培养基和照明光源条件下，数码相机采集的培养细胞透射光图像，获得的图像色温存在区别。LED光源视场下获得的图像色调偏蓝，而卤素照明灯光下拍摄的图像偏黄。对在特定光源下拍摄时图像偏色现象，可通过加强光源的互补色（如红色与蓝色）来修正。将在不同环境色温中白色物体调整成人眼视觉习惯的白色，叫做白平衡调整。如LED白光照明光源白色偏蓝，那么白平衡调整方法就是减弱蓝、同时增加绿和红光比例，使所成图像呈现为白色。

        白平衡滤光片特别适合染色细胞和组织切片的观察和成像。Olympus IXplore Standard（IX73）、IXplore Pro（IX83）显微镜提供的Light Balancing Daylight Filter（45-LBD-IF）即属白平衡滤镜。

2.3 吸热滤光片

        可吸红外波长光线的玻璃滤光片，可减低照明光中的热辐射对标本的影响。

参考文献

[1] 机标JB/T 8226.5－1999—《光学询价件薄膜·中性滤光膜》

[2] 张勇喜, 金秀, 杨文华, 等. 中性密度滤光片中性程度评价方法[J]. 光学仪器, 2013, 35(5): 85–89.

[3] Leica DMi8 Instructions for Use, Revision 1.1

[4] Leica DM IL Instructions

[5] Olympus IX73生物显微镜使用说明书

[6] Olympus CKX53光学显微镜使用说明书

[7] 吴京城，施露露，杜亚南等. 基于双重高斯滤波的细胞图像快速分割方法[J]. 激光与光电子学进展, 2022, 59 (2): 0210002, 网络出版