好恶不相似,是非无太明——关于微需氧工作站应用技术问题的讨论

       微需氧菌（microaerophilic bacterium）是指能在3% - 15% (v/v) 氧气含量环境下生长、在20-21%氧含量大气及无氧环境中生长受抑制细菌的统称。除了空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni ）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,HP）等报道较多的人体致病菌外，还包括肠道中微需氧型双歧杆菌，淡水、海洋硫化物等沉积物及废水生物膜中硫酸盐还原细菌（Sulfate-Reducing Bacterial, SRB），Zetaproteobacteria代表的近岸海洋沉积物、海底热液环境中的嗜中性微需氧铁氧化菌（FeOB）及从温泉中分离的微需氧菌等多种寄生菌。

       微需氧菌常在含5%-O₂,10%-CO₂和85%-N₂的气体环境、28- 42℃温度下培养。培养方法有玻璃缸蜡烛培养法、气囊培养法、厌氧罐培养法（Anaerobic Jar）、三气培养箱法（multigas incubator）和微需氧工作站（Microaerobic Workstations）培养法等。

烛缸培养法和气囊培养法难以稳定维持的气体含量。

       厌氧罐培养系统由气瓶、气体控制单元和培养罐组成，具有充排气的气体置换、氧气（1%-15%)和CO₂（5%-15%）浓度的自动控制功能，可提供稳定低氧培养环境。系统无法调控培养罐工作温度，故须将培养罐置于恒温培养箱、生化培养箱或霉菌培养箱中培养。

       三气培养箱(multigas incubator)具备常规微需氧菌培养所需的O₂（1% - 18%）、CO₂（0% - 20%）、温度（RT+5℃ - +50℃）及湿度控制条件，但缺少样品准备环节低氧操作环境。

       微需氧工作站集O₂、CO₂及温湿度自动控制功能于一体，既是天然的低氧培养箱，又兼样品制备的低氧环境操作台，为微需氧菌实验样品制备、接种培养和检测分析全流程的解决方案。既可置于普通实验桌面工作，也可订制专用工作台架连同气瓶、真空泵等辅助装置安装于实验室一角运行使用。

       厌氧工作站和微需氧工作站两者的整体结构基本一致，故有厂商将二者合称厌氧/低氧工作站，寓意可一机两用。事实上，二者的治氧目标、技术途径、硬件配置及支持气体均存在明显区别。本文基于工作站的气体环境调控机制来探讨微需氧工作站软硬件、配套气体需求的特殊性，以便读者在工作站的使用与选择上胸有成竹。

一、微需氧工作站的舱内环境调控机制

       微需氧工作站的一个核心功能是将工作舱内空气中氧分压从20.9%降至5-6%的水平并长期维持稳定。在运行前，工作舱内充填的是空气。

       若将空气理想化为由O₂-21%、N₂-78.1%及1%其它气体组成，无NO₂、H₂S、甲醛等有毒成份及尘埃污染的标准混合气体。则无需将舱内气体抽出一半后，仅输入CO₂、N₂，即可使舱内气体环境达到设定目标。

       但因地域、环境、气候及天气等条件影响，加之空气中的尘埃及硫化氢、挥发性有机物（VOC）、NO₂等有毒气体污染的存在，为确保最终气体环境一致性，标准流程应是先真空排出工作舱内空气，再按气体组成比例（如85%-N2：10%-CO₂：5%-O₂）输入高纯度工作气体来完成气体置换。

       在有氧呼吸链传递系统中，质子和电子的最终受体是O₂。菌体从环境中摄取1mol O₂可产生2mol水蒸气。微需氧菌一方面摄入CO₂，另一方面在有氧呼吸过程中消耗O₂并排放代谢产物CO₂和水蒸气。微需氧菌摄取CO₂的动机仍不十分清楚，但作为非固碳菌，理论上，培养过程中的排碳应高于固碳。最终结果是：工作舱内O₂消耗低于CO₂和水蒸气的尽增长，气体总量上升。

       微需氧菌通常需在含高浓度（5%-10%）CO₂的气体环境下培养。而系统根据O₂、CO₂传感器检测结果和控制算法，自动输入相应流量的O₂、N₂，将O₂、CO₂的气体分压恢复至设定水平。通过自动泄压装置释放部分气体，可保持舱内气压的正常。无论是工作气流输入、舱内气压维持，全部由系统自动控制，无需人工干预。

       高纯度的输入气体易造成培养基风干脱水。数字化湿度控制单元可控制直热式水汽蒸汽发生器或舱外水汽雾化装置，将舱内环境湿度维持在70% R.H.的默认值或更高（85-95% R.H.）设定水平。当舱内湿度超过设定值，系统则启动除湿机制，风扇驱动舱内气体循环，在流经半导体制冷控制冷凝器时，将水汽快速冷凝帮你改收集到舱外集水瓶中，从而降低舱内湿度。

       微需氧菌培养环境温度通常高于20℃-26℃的室温。系统通过升温加热和柜体自动对外辐射散热的控温机制，将舱内温度（RT+5℃-+65℃）维持稳定。

       可见，在气压与温湿度这几个工作环境参数调控、真空泵运用方面，微需氧工作站与厌氧工作站基本一致。二工作舱内气体环境调控的具体对象和调控机制，则存在根本区别。这就给微需氧工作站在配套体、硬件配置和系统控制层面都提出了不同要求。

二、微需氧工作站运行配套气体需求

       微需氧工作站舱要精确控制工作舱段O₂、CO₂两种气体的组成比例并保持稳定，必然要从外部引入O₂和N₂气体。在已知CO₂和水蒸气分子总量尽增长背景下，为维持5%-O₂、10%-CO₂和85%-N₂这一比例，O₂输入量必高于实际消耗量，同时补充N₂。

       假设某个培养阶段，工作舱内消耗了2体积的O₂、新增1体积的CO₂排放。则系统需输入输入2.69体积O₂外加10.1体积N₂，或直接补充12.81体积的压缩空气中（O₂组成比例约21%），将舱内O₂、CO₂比例恢复。可见，用单一压缩空气替代相对昂贵的N₂、O₂两种纯净气体用作舱内两种气体的补充来源方案，是经济而可行的。

       工作站的操作过程保留了N₂吹扫环节，以防外部空气经样品转移舱、袖套窗口与舱内气体对流而破坏舱内O₂稳态。因此，标准微需氧工作模式下，工作站运行所需配套气体为三种，即N₂（转移舱及操作袖套的N2吹扫）、CO₂（在初始阶段提供10%浓度的CO₂）和压缩空气（正常工作状态下舱内O₂含量的维持）。这与厌氧工作站的N₂+AMG、三气培养箱的N2、CO₂双气源供气模式都不同。

       包括幽门螺杆菌和空肠梭菌在内，超过200种病原菌携带有氢化酶基因。氢化酶（hydrogenases）的作用在物种、不同菌株间存在差异。氢化酶不仅在微生物呼吸链中摄入的H₂裂解成电子和质子，质子氧化产能产生PMF。一些肠道菌群还借助于氢化酶发酵产升H₂，并在肠道组织中扩散和饱和。幽门螺杆菌呼吸链中PMF产生具有结肠微生物群产H₂依赖性。鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、简易弯曲杆菌和幽门螺杆菌（包括致癌菌株）等几种病原体，利用宿主结肠组织中分子氢为呼吸基质（respiratory substrate），对其生长和毒力表现至关重要。实验证实，在培养气体中添加H₂，幽门螺杆菌菌体数量在16小时内实现40% - 60%的增长，且10小时内从[¹⁴C]碳酸氢盐积累的碳增加了3倍。H₂使得幽门螺杆菌在胃肠道定植（colonization）中保持关键的竞争优势。

       微需氧菌培养中是否需引入H2问题，目前学界并无一致意见。但空肠弯曲杆菌、幽门螺杆菌的培养气体中添加H2的应用（(5%-O₂, 2%-H₂, 88%-N₂, 5%-CO₂）早有报道。从目前公开报道看，多数微需氧菌实验用的是三气培养模式。

       加H2的办法是在微需氧培养三组气体基础上增加一路H_2-N₂混合气源。这样，H2、N₂、CO₂和空气构成了微需氧工作站的四气工作模式。

三、微需氧工作站的硬件配套要求

       厌氧工作站无论配置厌氧指示剂定性或氧气传感器定量监测，均可满足O₂含量控制在安全界限以下的调控要求。

       微需氧工作站在三气模式下，要实时定量检测O₂、CO₂两种气体含量，并根据传感器读数，自动调整压缩空气的输入量，确保O₂含量维持在设定值。而四气工作模式下，则须在三气应用配置基础上增加H₂传感器及配套气路控制单元。

       如采用肉眼观察氧气指示剂或氧气传感器读数，人工计算、手工控制各种气体的输入量，容易出现操作失误，以致舱内氧气含量偏离设定范围，危及样品安全。多个参数手工控制方式，极大增加操作负担，对操作者个人的经验和操作熟练程度要求极高，不适用于大多数的实验者。因此，微需氧工作站一般采用触摸屏操作设置工作，系统通过PLC核心控制器，根据实验设置集中对多环节、多参数自动化调控管理。市面上，DWS H35、江雪AG300 plus、Mini Station Plus、E500、E500G、QD500、E600，龙跃LAI-3T-N20、LAI-3DT等数字化自动控制的机型，是可以用作微需氧培养基础架构的。

       微需氧气体环境稳定须依托对多种工作气体流量的精确控制。采用三气运行模式的DWS H35、H25低氧工作站，设有N₂、CO₂和压缩空气三个独立气路接口，每个气路的流量、启闭都由系统独立控制。而DWS M35微需氧工作站是标准四气工作模式，内部气路结构与控制模块更为复杂。

       国产微需氧（低氧）工作站，一般基于标准厌氧工作站双气工作气路结构（一个N₂、一个AMG气体）设计，标准配置下无法直接管控3-4种工作配套气体。构建微需氧环境，须引入独立外置气体混合器模块。气路具体接入方法是：N₂瓶与机身N₂专用输入接口直接连接；CO₂、空气及H₂需与气体混合器上相应气体输入接口连接，通过混合器输出端口，与工作站的AMG输入口对接。气体混合器根据设置参数，可在多种气体间切换和根据指令选择性开放、关闭所需的气体控制阀。

       当然，系统软件首先得有CO₂、空气、H₂参数控制界面入口。DWS H35低氧工作站操作界面无H₂设置功能，可用于三气模式下的微需氧环境控制，但不适用于四气工作模式。

四、小结

       微需氧工作站集实验样品准备操作和培养于一体，有效弥补常规缸蜡烛培养、气囊培养、厌氧罐培养及三气培养箱的缺少样品操作空间上的不足。工作舱内O₂、CO₂、H₂、温度、湿度等工作参数全自动、实时精确控制，是实现微需氧菌、微需氧寄生虫（如蓝贾第鞭毛虫、阴道毛滴虫等）、哺乳动物细胞低氧培养应用的标准化实验工具。

       由于工作舱内气体调控对象、目标方法的差异，微需氧工作站从系统控制软件、舱内气体传感器配置种类、工作气体的输入与控制单元，与厌氧工作站的应用配置均显著不同。一般说来，通过简单的气瓶更换，微需氧工作站可以秒变为厌氧工作站；但厌氧工作站要实现到微需氧工作站的绚丽转身，单靠靠迈出切换气瓶这一步还远远不够。

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