好恶不相似,是非无太明——关于厌氧工作站运行气体管理问题的讨论

       厌氧工作站（Anaerobic Workstations），也称作无氧实验舱、厌氧培养箱（Anaerobic Chambers），是具有封闭舱体、可调控舱内气体组成与含量、温湿度条件的多功能实验箱。其核心功能是将舱内氧气含量控制在5 ppm（氧体积百分比0.0005%）以下，为厌氧微生物的样品制备分离、培养和鉴定提供了持续、稳定的无氧环境。工作舱既是优良的样品准备场所，又是标准的恒温恒湿厌氧培养箱。因此，作为基础条件装备，厌氧工作站已广泛而深入地应用在临床医学与动物疾病预防、致病菌药敏鉴定、食品工业发酵、极端微生物研究、微生物组研究（Microbiome Studies）、环境微生物学及生物能源研究等多学科领域。

       与生物安全柜、恒温培养箱、恒温摇床等其它微生物实验设备相比，厌氧工作站的系统结构、参数控制、操作流程和运行条件要复杂。为便于读者自觉、安全地使用与维护好厌氧工作站，本文从厌氧工作机制出发，来讨论工作站运行的气体管理问题。

一、厌氧工作站的除氧机制

       厌氧工作站通常采用物理手段（抽真空排气、氮气填充稀释）与化学手段（钯催化剂除氧）相结合的方法来简便高效地除去工作舱内氧气。

       先启动真空泵，快速地将工作舱内大部分空气排出，但仍有少量空气的稀薄分布。

       随后向舱内缓慢填充99.99%食品级高纯氮气（N₂），目的是将残留空气大幅稀释。充气完成后立即启动真空排气，完成一次氮气置换操作。氮气置换操作重复1-2次后，舱内O₂残量可低至0.1%上下。因真空泵工作性能及箱体结构强度限制，再继续增加氮气置换操作循环次数，对进一步降低舱内O₂含量不仅收效甚微，而且耗时、费气。此时，需要执行混合气置换与钯催化剂化学除氧流程。

       钯催化除氧的基本过程是：在2轮氮气置换操作完成后，向工作舱内输入含5%或10%比例H₂的厌氧混合气体（anaerobic mixed gas, AMG），即混合气置换操作。借助于金属钯对H2的强大吸附作用，用风扇使舱内气体循环流经钯催化剂层可将O₂捕获，并迅速催化O₂与H₂反应生成H₂O，气流将水蒸气带走。当舱内相对湿度过大时，工作站配备的湿度自动控制单元将其冷凝后收集并导出舱外。

       DWS公司的A20/A25/A35，Shellab公司的Bactron 300-2，龙跃LAI-3T-N20等新型厌氧工作站，采用了自动厌氧气体置换循环控制功能（automatic commissioning cycle）。按下此功能键后，无需人工干预，系统自动启动2轮氮气+1轮混合气的标准置换操作流程，直至工作站实现厌氧状态。

       厌氧工作站的化学除氧环节选择钯催化剂（palladium catalyst），有2个重要原因。

       一是钯金属对H₂、O₂所特有的超高吸附能力。

       气态分子和固金属表面的吸附是异相催化的基础。钯（Palladium, Pd）是铂（platina, Pt）系过渡金属元素，原子容易失去外层d轨道上的电子。吸附于金属表面的H2分子获得电子后，分子内部H-H键断裂，解离成H原子而活化，与Pd原子形成Pd—H共价键或Pd—H吸附键，这一过程称作解离吸附（dissociative-adsorption）过程。正是Pd—H化学键的形成，使钯表面吸附H2效率极高。常温下，海绵网状钯催化剂表面可吸附相当于自身体积850倍的H₂。

       大量活性H原子吸附在钯网表面，并可在钯表面自由移动，如同钯催化剂布置的巡逻兵。当遇到循环气流送来并与钯吸附的O₂时，凭借数量优势的H原子与O原子结合秒变成水，而水分子则自动从催化剂表面脱吸并被舱内循环气流带走。

通常，工作舱内气体经过数十分钟循环后，O₂含量即可控制在可接受的5ppm以下的安全水平，满足厌氧实验样品工作要求。

       二是钯催化剂的经济性。

       钯制剂的催化活性、稳定性和选择性俱佳，早已在石油、化工、制药和汽车发动机尾气处理等工业生产中实现了规模化应用和量产。因此，厌氧工作站采用钯催化剂除氧的方法，不仅技术上成熟、可靠和高效，而且钯制剂易于获得。

       将厌氧工作舱内的空气置换成厌氧气体环境走的是真空-氮气稀释-钯催化除氧的基本技术路线。而将舱内气体长期维持在安全厌氧水平，也是这一思路。

       正常运行状态下，工作站厌氧状态维持，主要是通过N₂吹扫和厌氧混合气体补充这2个措施来保障的。

1、进站N₂吹扫（flush lock），阻断外来氧源

       外来O₂进入工作舱主要通过实验样品容器转移舱（Flushing interlock or airlock）和手部操作窗（glove ports or sleeved ports）两个途径。

       为便于培养操作器皿、小型仪器和样品的批量转移。标准尺寸的厌氧工作站通常都设置专用的样品转移舱。转移舱有内、外两道密封门。内门打开后直通工作舱。外门开启时与实验室环境连通。内外门不可同时开启，以防止工作站内、外空气的直接对流。

       DWS A25、A35厌氧工作站具有转移舱内门、外门和氮气吹扫联动智能管理功能：内外门中任一道密封门处于开启状态，系统会自动限制另一扇门的开启，确保内外门不能同时开启；此外，转移舱未完成氮气吹扫时，也无法打开内门。这样可有效防止人为操作失误破坏内部厌氧环境。

       正常情况下，在内门关闭状态下，从工作站外将所需容器放入转移舱后并封闭外门后，立即进行转移舱N2吹扫操作。N₂吹扫与工作舱物理除氧原理和方法基本一致。

       厌氧工作站正常运行时，舱内气体对于站外空气、转移舱始终保持一定正压水平，万一工作站发生漏气，正压可阻止舱外空气进入舱内。转移舱处于保压状态时，内部气压低于工作舱气压也是出于同样考虑。

       转移舱N₂吹扫设置真空抽排气，主要是基于两方面的考虑。

       首先与厌氧工作站气体工作压力设置有关。英美品牌工作站的工作气体输入表压为0.2-0.6Mpa以上（2-6个标准大气压），高于转移舱内的气压。电磁阀开启，气体即可自动流入和充填气压较低的转移舱。而龙跃LAI-3T-N20等国产工作站所用的吹扫气瓶输出气压通常为0.05-0.08Mpa（0.5-0.8个标准大气压），不仅低于工作舱、转移舱内气压，也低于站外空气气压。因此，工作站内各舱段气体置换过程的充、排气都离不开真空泵的运行。特别是排气阶段，真空泵可令气体清除更彻底。

       其次是更有效地消除转移物品携带的氧气。真空排气过程中，被转移器具内部空腔所携带常压空气、样品溶液中的溶解氧气因真空效应更易于逸出而被一并抽离，减少随器皿转移带入的氧气。

       转移舱的N₂吹扫通常要进行2个循环，以尽可能驱除舱内空气。通常，在2轮N₂吹扫循环后还可增加一个混合气充填步骤，再将物品转入工作舱。转移舱容积不过10-40L，吹扫操作可在15-20分钟内完成。吹扫过程也可由自动程序控制来完成。

       袖套式操作窗通常也需执行N2吹扫操作。

2、厌氧混合气补充消除氧气增量

       N₂吹扫循环通常难以彻底消除实验用品具、手部出入工作站时吸附于皮肤以及手与乳胶手套间隙中携带的少量O₂。此外，而舱内样品溶液所携带的氧气也会陆续释出。

       厌氧工作站配置的氧气指示剂或高精度氧气传感器，用于指示舱内O₂含量。

       当外源性氧气积聚势必造成舱内氧含量的上升。当升幅足以触发氧传感器读数改变或指示剂颜色改变足以为操作者肉眼可分辨的程度时，在手工操作或系统PLC自动控制下，向舱内缓慢（通常流速可低至10mL/min）注入相应体积的氢气，将多余的O₂清除，直至舱内重新恢复到安全厌氧状态。

二、厌氧工作站运行配套气体需求

       厌氧工作站运行的气体有两种，高纯度N2和混合气体AMG。N₂的作用是用于工作舱、转移舱和袖套的气体置换，工作流速可高达10-25 L/min，消耗量大。AMG主要作用包括气体置换和运行过程化学除氧两方面。可见，两种气体中，AMG是刚需。

       AMG是由N₂、H₂和CO₂三种气体按一定比混合后制成的。既然N₂、H₂即可满足运行要求，为何要添加CO₂？这是由N₂、H₂和CO₂三种气体各自的生产、储运条件特殊性决定的。

       N₂的临界温度（Curie temperature/Tc，即物质气、液态共存并达到平衡时温度）-146.9℃，临界压力3.3978 Mpa。只需常温下将N₂加压到3.3978 Mpa，或在常压下将N₂气降温到-146.9℃，就可获得液氮。

       CO₂的Tc为31.1℃，临界压力7.3 Mpa。常温下加压到6.0 Mpa就可得到液化。液态CO₂可在-37℃下稳定储存。

       H₂在标准大气压下冷却至Tc -240℃后才能液化，且液氢须在-253℃低温容器中储存，生产、储运成本远高于液N₂和CO₂。

       液氮生产成本低，液氢储存使用条件苛刻。液态CO₂不仅成本较低，重要的是通过添加CO₂将液态混合气体的沸点温度升高，对提高储运和使用的安全系数大有裨益。

       实践中，厌氧工作站有单一AMG供气（Single Gas Configuration，SG）和N₂+AMG双气体供气（Two Gas Configuration, TG）两种运行模式。

       工作站运行气体消耗量，与工作站的使用频率、转移舱内部容积大小和物品出入次数有关。

       Mini Station、AG300及Basic I这类迷你型、小型厌氧工作站，系统气路及气体控制单元结构简化，小型化设计有利于降低建造和购置成本。小巧的工作舱空间不过130L，单一AMG实施各舱段气体置换和厌氧环境维持的气体消耗仍十分经济。据悉，Mini Station厌氧工作站单一AMG气体工作模式下，标准40L容量钢瓶（≥10m³气体）可持续供气多约28周。

       而标准尺寸厌氧工作站，工作舱容积300-500L，转移舱容量40-50L，采用单一AMG气体运行，标准40L气瓶可持续供气2-3周。通常，大容量工作站用户采用双气工作模式的运行成本更低。A20、A25、Bactron 200-2等小型工作站以及A35，Bactron 300-2，E400、E500G、LAI-3DT及LAI-3T-N20等标准型厌氧工作站，都采用了双气运行模式。这类工作站机身设有N₂和AMG两种气体输入接口，系统的气路结构及气体控制单元相对复杂。

       厌氧工作站的PLC控制芯片是根据O₂传感器测试值，基于内置算法来通过控制AMG气体流量来调控工作舱氧含量。如AMG气体组成及比例与系统控制标准不匹配，必然危及舱内厌氧环境的安全稳定。

       目前，厌氧工作站用的AMG组成比例有两个技术标准。

       英式AMG标准设定的气体组成比例为80%N2+ 10%CO2 + 10%H2。英国DWS的A25和A35，Electrotek 品牌AW200SG与AW300SG，江雪MiniStation、E200、E500系列厌氧工作站即执行该标准。

       美式AMG标准规定气体组成比例为5% CO2+5% H2+90%N2。Shellab品牌的Bactron 200-2、Bactron 300-2系列工作站，龙跃LAI-3DT等厌氧工作站沿用该标准。

       实际工作中，AMG的订购和使用须严格依具体设备型号所执行AMG标准执行。

三、结语

       厌氧工作站是采用小型气泵按固定流速抽取舱内气样输入检测单元来测定和指示舱内氧含量情况的。因采样点、采样流速和工作舱内部容积大小的限制，系统厌氧状态指示所反应的只是某个时段、局部厌氧状态，具有时间上的滞后性和空间局限性，并非工作舱内所有位点、所有时段氧含量的真实水平。

       而实验器具（移液器、吸头、移液管、培养皿、试剂瓶、培养瓶等）及试剂溶液携氧难以避免。如刚移入工作舱便立即进行厌氧操作，这部分输入性氧分与舱内气体交换，会造成厌氧状态波动，但却难以及时被系统氧检测或指示单元所感知，造成系统除氧反应滞后。实验器具越多，器具用品内部充气空间和溶液体积越大，则输入性氧成份污染危害越大。

       我们建议，大量站外实验用品输入工作舱后，应将器具开盖静置足够时间，确保输入氧气释出、触发系统厌氧维持机制后，再实施氧敏感样品的操作。

主要参考文献

［1］LAI-3厌氧培养箱使用说明书
［2］AG300厌氧工作站使用说明
［3］Labgic AI-TS-5厌氧培养箱操作说明书(2022.7版)
［4］DWS A35厌氧操作培养箱操作说明
［5］Anaerobic Workstation AW400TG Two Gas Version Manual
［6］BACTRON Anaerobic Chambers Installation and Operation Manual（Rev. July 8, 2022）