关于超滤离心管工作离心机转头选型问题的讨论

       超滤离心管是依托超滤膜（ultrafiltration membrane）的过滤孔径对不同分子量大小组分截留功能，用离心力驱动溶液在滤膜表面流动时，盐分、引物、EDTA、污染物等小分子量溶质及溶剂在离心力作用下穿透滤膜滤出，而蛋白质、核酸（DNA/RNA）、外泌体及细微粒子（如微珠、纳米材料）等目标组分则被截留下来并被收集，实现样品中不同组分分离的。只需一个简单操作步骤和短短数十分钟，就同时实现了样品组分的纯化、浓缩两个目标。可重复性好，样品回收率高。所需工作条件温和可控，有利于保持生物组分的生理活性。因此，超滤离心管处理法在蛋白样品脱盐、浓缩和缓冲液更换，高品质核酸模板的制备等实验环节都得到广泛应用。

       超滤离心管由超滤膜过滤器和离心管两部分组成。过滤器上部为圆柱型储液区。中部为扁平、呈V型过滤区，核心是双排垂直滤膜（twin vertical membranes）。下部为封闭的浓缩液收集槽。工作时，溶液沿着与滤膜表面平行方向（切向）流动，溶剂连同可滤除的小分子组分从滤膜渗出并被甩入离心管底成为滤出液。被滤膜截留的样品组分则随切向液流进入浓缩液槽。随着离心的启动，滤出液增加而储液区溶液减少。最终,偌大的滤器内仅剩浓缩液槽内收集的数十～数百微升含目标组分的浓缩液。

       本质上，超滤离心管相当于一套安装于标准锥形离心管内的超滤膜过滤器（Centrifugal Filter Devices, Centrifugal Ultrafiltration Units）。超滤器的操作压、渗透通量、管最大样品处理量、浓缩液体积和有效工作时间，均受控于离心机转头的工作性能。纯化浓缩操作是用角转头还是水平转头，转头实际输出性能是否符合超滤管工作要求，对实验者而言，这是事先应予明辨的重大议题。

一、离心机转头属性对超滤离心管工作效能的影响

1.1 离心机转头的工作角度

       转头的工作角度决定了超滤离心管的最大样品载量、滤膜有效工作面积、95%截留率时的有效离心时间及浓缩液体积等多个工作指标。

       首先是管的样品承载量。水平转头中，超滤管在离心前后始终处于竖直状态，这有利于实现装填样品体积的最大化。角转头在静止时，样品管呈倾斜状态。故在填充移液时管上部须预留足够的闲置空间，以防样品溶液上机安装时外溢。角转头倾角越大，管有效上样容量越小。如Cytiva Vivaspin 20蛋白浓缩管，在水平转头中工作时最大载样量为20mL，而采用25°角转头离心则样品最大体积骤降至14mL。

        其次是滤膜工作面积。超滤离心管在水平转头中工作时，V型排列的双膜处于同步工作状态。较大的有效滤膜表面积，有利于高效过滤浓缩。而超滤离心管安装于角转头中时，只有靠外侧的一个膜单元有身体滤液发生，内侧的另一个膜处于闲置状态。因此，此时滤器的膜总有效工作面积只有水平转头时的一半。

       第三是浓缩液的回收体积。水平转头离心过程中，滤器内样品液面界线由内向外水平推移。当液面越过滤膜外侧末端进入死体积腔时，液面与滤膜脱离接触，则膜过滤停止，样品浓缩达到最大程度。       

        而角转头中的离心末期，液面位置分布与在水平转头中的不同。尽管储液区剩余样品溶液不足以覆盖单侧滤膜全部表面，但此时液面依然与滤膜保持有效接触，被浓缩液体与膜接触时间长于在水平转头中浓缩液-滤膜接触时间。因此，在角转头中操作所得的浓缩液体积往往小于水平转头的所得。但同时，用角转头离心样品出现过度离心的风险更高。

1.2 离心机转头的RCF输出性能

       超滤离心管的工作动力来自转头产生的离心力。在超滤膜耐压范围内，通过适当调整转头RCF输出来提高操作压，如从RCF 4000×g升至5000×g，能增加膜流速，促进与膜吸附的目标组分的解吸附，维持样品的高回收率。

       将过滤区左右两侧壁膜间的夹角表示为a，水平方向离心力用F表示，则此时F可分解为垂直于滤膜的Fm和平行于膜的Ft两个分量。两个力的分量分别发挥促使液体穿透滤膜滤出、沿滤膜表面向液槽底部流动的驱动作用。

       在水平转头中，膜间夹角a通常很小(20°以内)，故Fm = F. sin(a/2)较小，而Ft = F. cos(a/2)较大。

       较小的Fm意味着水平离心时作用于样品溶液的操作压强小。

       较大的Ft有利于降低目标组分与膜的非特异性吸附，从膜表面流入V型槽底，有助于提高样品回收率。

       若规定角转头自身倾角为θ，大小介于为20°- 45°之间。此时，Fm = F·sin(90°-θ+a/2)。显然，角转头中产生的Fm大于水平转头中的Fm。

       Fm的增大提高了超滤膜的操作压，而膜通量（flux,指单位时间内单位膜面积滤过样品体积）也相应增加，这样可弥补角转头中因膜有效工作面积减少的渗透通量损失，可将膜的通量维持在较高的水平。

       理想的超滤性能，需要操作压（operating pressure）、切向样品流速大小的适度与二者间的平衡。

       进样操作压小，则溶液中小分子组分透膜动力不足，膜渗透通量低。但切向驱动力过大，则会抑制小分子量组分的跨膜渗透，膜滤过通量下降。

       相同RCF设置下，角转头离心力的两个分量Fm和Ft，随转头倾角θ的改变而此消彼长。主流品牌离心机角转头倾角有25°、35°和45°之分。工作转头的倾角θ增大，会导致Fm的降低和Ft的增加。这直接导致滤膜操作压下降和切向流速的加大，膜通量降低，使操作时间延长。

       赛多利斯、Cytiav Vivaspin超滤离心管使用说明建议用25°角转头。这不仅是因为25°转头的样品最大载量相对较大，更重要的考量因素是25°角转头中的Fm和Ft两个离心力分量间的平衡。

分析表明：

       (1) 只要遵循超滤离心管使用指南提供的转头、RCF值、离心时间条件操作，无论采用角转头、水平转头离心，都有望获得理想的结果；

       (2) 水平转头上样量大且回收率高，在转头RCF满足要求情况下，选择水平转头离心值得肯定；

       (3) 采用角转头工作时，超滤管最大载样量小，但最终浓缩液体积往往较小，故特别适合低丰度组分的浓缩纯化。

二、理想超滤离心效果对离心机转头工作性能的要求

       正因为超滤离心管的工作中采用的离心力大小及转头倾角，对超滤渗透流量、样品回收率有重要制约效应。因此，不同截留分子量（Molecular Weight Cutoff, MWCO）的滤膜、不同样品容量管在水平、固定角度两种转头，工作所需的RCF设置不同。概言之，50mL-100k Da超滤管工作RCF为3000-6000×g，50mL-3k - 50k Da管所需RCF为4000-8000×g，15ml管工作设定的RCF高于50mL管。

表1. 品牌超滤离心管工作RCF参数列表

       超滤离心管使用说明文件中，一方面RCF标注为滤膜工作最大RCF值。而另一方面，在产品超滤性能演示实验中，所用RCF设置通常正是该限定值。

       操作条件低于产品指南建议RCF设置，小分子物质穿膜动力不足，不仅使离心时间延长，关键是长时间离心后溶质在膜表面浓度极化效应，使溶质易于在膜表面附着和沉积结垢，一旦膜过滤孔径和有效面积降低，会造成膜工作通量和样品回收率的下降，这对离心超滤效果是致命的。因此，实验者对超滤离心所用转头，特别是水平转头的实际工作性能应准确了解，在转头的选择上务必谨慎。

       超滤管离心需要何等性能的水平转头？这一问题要从超滤离心管结构的特殊性和水平转头工作有效RCF输出两个角度来分析。

       超滤离心管的膜过滤区，整体上位于离心管长轴中点偏内侧、跨越水平转头平均离心半径（average radius，R_av）的位置。滤膜工作中所处的离心力场相对强度（Relative Centrifugal Field, RCF）与转头Rav所在位置对应的RCF平均值（RCF_av）大小接近，但小于转头R_max处的最大RCF值(RCF_max)。以Himac 4×50mL锥形管水平转头R-8S为例，其RCF_max为11500xg，是平均半径处RCF_av值的1.46倍，远大于滤膜所处位置的实际RCF强度。

       可见，水平转头标示的RCF_max达到超滤离心管工作的RCF设置值，并不等于转头的有效RCF输出达到超滤管最佳表现所需工作条件。只有转头的RCF_av达标，转头RCF输出性能才视为与滤膜理想工作状态所需RCF强度相匹配。

       Beckman Allegra 25R离心机的4×500mL水平转头TS-5.1-500，可配置50mL锥形管 (30×120 mm)适配器、15mL 锥形管(17×120 mm)适配器，是超滤离心管使用指南中披露的转头选项之一。

表2. TS-5.1-500水平转头不同转速下RCF输出值

        数据显示，4000×g RCF的设定，TS-5.1-500转头对应工作转速为5080rpm，已直逼其额定最高转速5100rpm的极限。

        Pall Macrosep Advance的50mL超滤管RCF建议值为5000×g，已远超TS-5.1-500转头RCF_av输出能力范围。显然，TS-5.1-500转头并不适用于Pall Macrosep Advance超滤管，而适用于Vivaspin 20、Vivaspin 6、Vivaspin Turbo 15、Vivaspin Turbo 4和Amicon Ultra-15。

       这提醒我们：并非所有配置有50mL、15mL锥形管适配器的水平转头都能适应上述超滤离心管工作所需的RCF输出要求。

       角转头则不同，其额定转速通常高达8500rpm以上，可轻松实现RCF_av 5000×g的输出目标，对各品牌超滤离心管工作适应性要优于水平转头。

三、超滤纯化浓缩实验中离心机转头选型的解决方案

       根据RCF计算公式可知：

⑴相同离心半径下，工作转速相同则RCF相同；

⑵增加转速可加大RCF输出；

⑶更大的离心半径，可实现相同转速下更高RCF输出。

       将RCF_av输出值规定为4000×g，可计算出不同额定转速的转头对应的平均离心半径值（R_av）。在此基础上，以Falcon 50mL锥形离心管、15mL锥形离心管各自管身长度的一半，即51 mm、55 mm，分别“嫁接”到水平转头的平均离心半径上（计算原理同样适用于角转头，限于本文篇幅，在此不予讨论），即可得出这两种标准尺寸超滤离心管适用水平转头最大离心半径值（R_max）。

表3. 超滤离心管4000×g离心水平转头最大离心半径(R_max)表

       水平转头工作性能与超滤离心管工作要求匹配程度评估方法是：

       第一步，根据实际所用转头的额定转速值，找到表中该转速对应的转头R_max计算值；

       第二步，将查到的R_max计算值与离心机制造商样本资料中该转头R_max实际值比较。

       第三部，如转头的R_max实际值大于等于R_max计算值，则该转头满足该超滤管所需理想工作条件。否则，则视为该转头性能无法确保超滤管工作表现处于最佳状态，不建议使用。

       验证实例1：TS-5.1-500 水平转头最高转速5100 rpm，R_max 190mm大于50mL超滤管离心对应的RCF_av值189 mm，故TS-5.1-500满足此超滤管4000×g的工作要求。

       验证实例2：Sorvall Legend RT Plus离心机TTH-750水平转头，最高转速4600rpm，R_max 192 mm。表中与4600rpm转速对应的50mL超滤管Rmax计算值为220 mm。R_max实际值与计算值相差过于悬殊。故TTH-750水平转头无法与4000×g的RCF离心要求匹配。不单TTH-750如此，TX-1000（4×750mL/4200rpm/ R_max 209mm）、TX-740（4×750mL/4700rpm/ R_max 195mm）和TX-400（4×750mL/5000rpm/R_max 168mm）均不适用于此规格管工作RCF最佳条件要求。

       表3数据表明，凡不能适应50mL超滤离心管工作要求的转头，亦无法作为15mL超滤管最适工作条件的选项。

       基于以上分析，表4中列出了可用于50mL超滤离心管4000×g工作要求的部分离心机水平转头。

表4. 部分50mL超滤离心管适用的离心机水平转头

四、结语

       离心力（centrifugation force）与样品粒子自身质量、某一时刻其所处位置的离心半径和转头角速度的平方成正比。样品溶液中不同分子量的分子、颗粒等，如质量大小存在差异，即便所处离心半径相同，所受的离心力大小也不相同。同种质量组分，处于管内不同离心半径的位置，所受离心力也存在差异。因此，离心力的讨论永远绕不开粒子质量大小这一因素。

       物体在重力场中承受重力。而在转动的离心机转头内，微观粒子还同时置身于离心力场（centrifugation field）环境中。将某一时刻粒子所受离心力与重力的比值定义为离心力相对于重力的相对大小，即“相对离心力大小”（relative centrifugation force）后，则相对离心力大小与粒子种类、形状、质量大小都不再存在联系，只与转头工作的角速度和粒子在转头中的离心半径有关。在离心机专业技术资料中，习惯上用离心力场对重力场的相对强度，即相对离心力场强度（relative centrifugation field, RCF）来表征所有种类的微观粒子所承受的相对离心力的大小，并指定用缩写“RCF”（单位为×g）予以表述。

       驱动超滤离心管内样品组分、粒子运动的有效RCF是粒子所在位置的实际RCF大小。粒子运动在转头内不同离心半径部位时，所处RCF环境不同，运动状态也不同。不同的转头类型、不同转头的RCF_max值大小可能接近，但实际有效RCF输出则大相径庭。因此，在科学出版物中，标明实验所用转头型号（读者据此便可查找到转头的R_max、K因子、最高转速及RCF_max值）、转速和平均离心半径（R_av），要比简单、笼统地披露一个RCF数值，对同行更具有参考价值（因为根据转速和R_av值，可计算出转头的RCF_av，还能验证参考文献所提供RCF值的有效性）。

        就超滤离心应用而言，用转头的RCF_max来衡量超滤离心管的实际工作效能，技术上不可取。RCF_av值可更准确反映管内样品实际所受离心力作用大小。考察特定转头是否有助于特定超滤离心管实现最佳工作性能，一个简单有效的指标便是RCF_av。

       多年来的业内外超滤离心实践表明，要充分发挥超滤离心管工作效能，遵循超滤管说明书建议的工作条件是完全必要。而从目前看，超滤管离心的最适RCF要求，与多数实验室离心机所配置水平转头工作性能间存在着错位。对现成的离心机转头配置，不加详查，贸然“就地取材”实施操作，极有可能偏离超滤管最佳离心条件。这一点，在水平转头中尤其须引起重视。

       角转头的优势在于其额定转速具有很高冗余度，可通过调节工作转速实现2000 -10000×g超宽范围的RCF_av输出，足以覆盖各品牌、规格的超滤离心管工作所需RCF设置范围。因此，为F15-6x100y、F-34-6-38、F0685、JA-18这类中等容量甚至大容量JLA-16.250、R12A3高速角转头配置50mL、15mL锥形管适配器，或采用F13-14x50cy、FA-45-6-30、C0650、JA-14.50、R15A及18A这类锥心管专用角转头，可为综合型实验平台带来应用范围的充分可扩展性和灵活性。

参考文献

Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices User Guide (PR05035, Rev. 10/18)

Vivaspin Turbo 4 and 15 Technical data and operating instructions (Sartouris)

Cytiav Vivaspin 500_2_6 and 20 Instructions for Use

Macrosep Advance Centrifugal Device Operation Instructions for Use (PN 89113C)

Instructions For Use JA-14.50 Fixed-Angle Rotor (PN B32164AC)

R8S Swing Rotor for Refrigerated Centrifuge Instruction Manual (S99806208)