关于大容量锥形离心瓶在科研实验中应用问题的讨论

       Conical Centrifuge Tubes或Conical-bottom Centrifuge Bottles，因瓶体长度中近三分之一呈圆锥形，故称作锥形离心瓶、尖底离心瓶。

       通常，组织培养实验中胰蛋白酶消化后的活细胞离心，分子生物实验中细菌离心收获（harvest）及大容量组织匀浆或细胞裂解液的澄清（clarifying）等常规中低速实验，依托台式离心机即可实施操作。而锥形瓶因底部特殊造型，有利于样品组分离心形成的颗粒物（pelleting）聚集分布在瓶底锥间一小块区域，对最大程度收集沉淀或倾倒上清十分方便，因此深受实验人员喜爱。

       工作中我们注意到，对锥形离心瓶的使用，可能还存在一些认识上的误区，技术上也有亟待扫除的盲点。为此，本篇尝试从离心机转头工作原理、锥形离心瓶外形特点与实验应用要求三个角度，探讨锥形瓶在科研实验中应用方法这一问题。

一、锥形离心瓶的运用是否不可替代？

       要澄清这一问题，需要从锥形离心瓶在水平转头和定角转头两种离心模式下对其样品组分沉淀生成原理加以具体分析。

       如图1所示，当采用水平转头离心时，样品组分粒子在数百至数千倍重力的离心力作用下，克服液体的阻力水平方向发生沉降运动。大部粒子前进、深入离心瓶锥体后，会遭遇瓶壁的阻挡。而此时，水平方向的离心力可人为分解成方向垂直于锥体侧壁和平行于锥体的两个分力。粒子沉降方向变化，将紧贴、沿着瓶壁向外侧继续迁移。这将使瓶底部样品粒子密度激增，进而粒子聚集形成有形颗粒而沉淀。

       在锥形瓶底的约束和强大的离心力作用下，沉淀颗粒向下、向外迁移而堆积集在锥顶一狭小区域内。而在平底（Flat-Bottom）或圆底（Round-Bottom）离心瓶中，粒子可保持水平方向沉降直至瓶底，因此，沉淀颗粒物可散布至整个瓶底范围。

       对于需要回收沉淀组分的应用，如培养的酵母菌、细胞等，沉淀分布越集中，越利于完整回收，减少损耗。而对于细胞器制备中采集上清、去除死细胞及细胞碎片组分操作，平底瓶中沉淀过于分散，倾倒上清过程中往往容易有沉淀颗粒被液流荡涤裹挟而混入。为避免沉淀污染而废弃瓶底部分上清，必造成上清损失。因此，水平离心操作应用中，采用锥形瓶有助于实现样品高回收率。

       离心瓶若采用R10A5、JLA-10.500等固定倾角转头离心，则情况有所不同。

       如图2所示，将两种离心瓶置于具有26°倾角的角转头R10A5中离心时，在300×g RCF及更高RCF离心条件下，样品颗粒形成后会趋向离心瓶的最大离心半径处聚集。锥形和平底两种离心瓶中生成的沉淀均呈局限性分布。

       理论上，转头倾角（通常为20°- 30°范围）增大，则两款离心瓶中沉淀斑的重心将靠近瓶壁、瓶底交界线，沉淀分布范围扩散。平底离心瓶的最大离心半径处呈90°夹角，而锥形瓶相应位置的瓶体夹角近135°。相同样品离心条件下，平底离心瓶中沉淀斑块要比锥形瓶内的小且厚实。

       可见，锥形瓶无论是在水平转头、角转头中离心，都具有沉淀分布局限化的特点。但这并非锥形瓶的专利。将平底离心瓶置于角转头中工作时，也可产生与锥形瓶水平离心近似的分离效果。

二、锥形瓶主要适用于中低速离心？

       从病毒样颗粒（Virus-Like Particles，eVLPs）、腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体分离到干细胞的分离，从化合物抗菌活性研究到蛋白翻译后修饰、染色质相关蛋白复合物（protein components of chromatin associated complexes）分析等众多科研实践中，人们将锥形离心瓶用于细菌、酵母菌、sf9昆虫细胞、哺乳动物细胞及模式生物秀丽隐杆线虫的大规模培养后的收获操作。

表1 品牌锥形离心瓶实验应用报道举隅

       资料表明，从大量的酵母菌、厌氧菌、大肠杆菌、秀丽隐杆线虫、组织细胞及蛋白真核细胞表达系统等起始材料中提取质粒、细胞核、蛋白、病毒类颗粒时，大容量锥形离心瓶的使用可为操作提供极大方便。

       哺乳动物细胞、昆虫细胞培养物的收获离心操作常用RCF 200 - 2000×g的设定。培养菌体的收集时RCF设置以1800 - 3000×g居多。

但锥形离心瓶并非如只能进行RCF 7000×g以下的中低速离心。根据文献11报道，Corning 250mL锥形瓶（430776）在高达10000×g RCF条件下正常工作是可行的。事实上，Nalgene、Nunc等厂商为高速离心应用提供了可耐受RCF 10000xg离心的锥形瓶。就文献10和11实验应用而言，条件许可时，采用Nalgene 3144-0175、3143-0175两款175mL锥形离心瓶完全可行。

       因此，在大规模质粒和蛋白提取、外泌体等细胞器的差速离心分离、噬菌体PEG分离等应用中，大容量、高速锥形离心瓶的引入将给操作流程带来事半功倍的效果。

三、锥形离心瓶运用需面临的问题

       锥形离心瓶下部为锥体造型，在瓶体外径、带盖工作高度相同情况下，锥形瓶的有效容量低于常规平底离心瓶。将Corning 430776锥形离心瓶(250mL；59.7×161 mm)与Nalgene 3120-0250平底离心瓶（250mL；61.8×125.2 mm)、Corning 431841旋盖离心瓶（250mL；60×128 mm）对比，一眼便知。

       而锥形瓶要扭转容量上的相对劣势，只能从增加瓶体的高度或（和）瓶体直径这两方面挖掘潜力。以500mL 的Corning 431123锥形离心瓶(95.5×146.8 mm)为例，其瓶身远比相同容量的Corning 431846密封盖离心瓶(69×170 mm)、Nalgene 3120-9500离心瓶(69.5×158.9mm)粗，已达到1L Beckman C31597离心瓶（96×191mm)和Himac 1000PP广口离心瓶(98×170mm)的体量。

       瓶体高度增加或直径加大，使锥形瓶无法用于针对相同通量平底离心瓶尺寸设计的转头。事实是：

1）额定容量250mL的Nalgene或Corning锥形离心瓶，无法安装到6×250mL角转头中离心；

2）无论是5804R离心机S-4-72水平转头，或5810R的A-4-62水平转头，转头配套的250mL离心瓶适配器只能承载Nunc 200mL （376813）、Falcon （352076）锥形瓶；

3）500mL 锥形瓶，不适用于4×500mL的A-4-81水平转头，只能在Multifuge-X4R pro的TX-1000或TX-750、5810R的S-4-104水平转头以及Avanti J-HC的JS-4.2等4×750mL及4×1000mL的大容量水平转头上使用。

因此，锥形离心瓶的使用不如平底离心瓶灵活，它对工作离心机配置资源是有技术门槛限制的。

四、锥形瓶离心运用的离心机资源条件

       锥形离心瓶正常工作需要有工作容量可与之匹配的离心机、转头及锥形瓶相应适配附件配置做支撑。

4.1 离心机主机平台的性能要求

       若是常规培养细胞、菌体离心收获或收集上清，转头Max RCF达到3000-4000×g能满足操作要求，则配置4×250mL及更大容量水平转头的台式离心机，即具备锥形离心瓶使用基础条件。

表2 常用品牌锥形离心瓶工作RCF参数表

       文献报道中常用的Falcon 175mL锥形瓶352076，外径60.7mm，带盖总高度120.4 mm，可与多数主流品牌台式离心机的4×250mL水平转头兼容。如Multifuge X1R Pro的TX-400转头（4×400mL/62×135 mm/4696×g）、eppendorf 5804R的S-4-72转头（4×250mL/62×130mm/3234×g）、Sigma 3-16K或3-18K的11180转头（4×400mL/62×139.2mm/4200×g)，Allegra X-30R配备的SX4250(4×250mL/61.6×125mm/3900×g)等，均具有支持Falcon 175mL锥形瓶离心的能力。

       若样品离心力要求高（如RCF超过5000×g），虽然仍处于离心瓶的安全离心力限度范围，但符合实验要求的台式机转头稀缺。此时，Avanti J-E、Avanti JXN-26、Himac CR22N、Sorvall LYNX 4000等大容量立式离心机是较理想的解决方案。就Falcon 175mL锥形瓶而言，如立式离心机中的Avanti JXN-26的JLA-16.250角转头和JS-7.5水平转头（4×250mL/62×136mm/10400×g）、Avanti J-E或Avanti J-26S XP离心机的JLA-16.250角转头或JS-5.3 ALLSPIN水平转头（4×500mL/6670×g）、Himac CR22N的R14A、Sorvall RC-6 Plus的SLA-1500角转头都可作为资源选项。

4.2 转头工作容量的要求

       锥形离心瓶比同等容量的平底离心瓶要高，除去Falcon 352076、352075两款锥形瓶，Corning 250mL锥形瓶、Nunc 200mL锥形瓶及Nalgene 175mL锥形瓶都均无法在目前在产标准6×250mL角转头中安装，只能在6×500mL、4×1000mL、6×1000mL大容量角转头或工作容量4×500mL、4×750mL及4×1000mL水平转头中使用。

       这使得离心机常规实验应用定制的容量转头和配置方案，很可能无法满足实验室现有锥形瓶运行要求。如Mutifuge X4R Pro离心机的F14-6x250LE角转头(6×250mL;62×125 mm)、eppendorf 5804R的S-4-72水平转头（4×250mL; 62×130 mm），5810R的A-4-62水平转头（4×250mL;62×136 mm）等，都面临这一问题。

4.3 锥形瓶适配附件的要求

       锥形离心瓶无论在何种转头上使用，均须用离心机转头配套锥形瓶专用适配器或离心瓶制造商提供的离心瓶适配器（centrifuge Bottle adapter）或瓶垫（centrifuge Tube cushion，Bottle insert，Bottle cushion）垫于瓶底。

       不同离心机制造商、转头可提供的配套适配件功能类型不尽一致。

       锥形瓶与转头可有两种工作组合模式。

       一种是角转头常用的圆底瓶适配器+锥形瓶垫+锥形瓶模式。此模式是先在角转头离心孔底安装平底离心瓶适配器，适配器上方叠放锥形瓶垫，最后将离心瓶安装在瓶垫上。250mL锥形瓶在Avanti JXN-26立式离心机JLA-10.500角转头（含362750适配器）、Himac CR22N离心机R10A5角转头和Sorvall LYNX 6000 F12-6x500LEX角转头（含010-0152适配器）上离心，均属于这种模式。

       第二种是水平转头用的离心瓶+锥形瓶专用适配器模式。这就需安装离心机制造商专门为锥形瓶量身定制的锥形瓶适配器。专用锥形适配器的外部与平底离心瓶底部尺寸一致，可与转头离心孔底部紧密贴合。其内面为锥形，与锥形瓶底部严丝合缝。Multifuge X4R Pro离心机的TX-1000和eppendorf 5810R的S-4-104转头，均自带Corning 500mL锥形瓶适配器。将此适配器在吊篮中安装就位后将锥形瓶插入适配器即可，无需使用Corning 500mL锥形瓶垫431124即可实现安全离心。TX-1000转头还可提供另一款适配器75005392，用于62×145mm尺寸瓶体，可兼容250mL Corning 锥形离心瓶、200mL Nunc 锥形瓶及175mL Nalgene锥形瓶。

4.4 锥形瓶高度范围的要求

       业内所标注的锥形瓶高度通常指的是离心瓶合盖后总高度。不同品牌、型号和容量的锥形瓶高度存在差别。

表3 品牌锥形离心瓶外形尺寸表

       实验者更应关注离心瓶的工作高度参数。

       锥形离心瓶的工作高度是指离心瓶与瓶垫或转头的锥形适配器组合后的总高度。通常，瓶-垫组合体的高度比离心瓶高度多出5-10mm。评估锥形离心瓶与工作转头时匹配程度时，瓶垫的增高作用不可忽略。

       不同品牌、型号转头适用的离心瓶高度范围不一。

       锥形瓶的瓶盖高近2.5cm，而直径约为瓶体直径的一半。手指捏紧瓶盖即可轻松完成样品瓶在角转头或水平吊篮适配中的装卸。故锥形瓶的瓶体高度低于转头建议标高，并不妨碍离心操作。
       但瓶体工作高度超标情况则大为不同。忽视转头可接受的离心瓶工作高度上限强行上样，轻则影响转头盖或吊篮密封盖的正确安装，重则在转头启动、吊篮向内侧摆过程中，瓶盖与转头轭部（Yoke）接触而极易引发离心安全事故。
       因此，锥形瓶瓶体高度应秉持“从低不从高”的原则。

       无论哪种离心瓶与转头属工作组合，锥形瓶离心操作只有在与离心机管理员、技术服务人员确认设备配置符合特定锥形瓶工作条件时方可进行。

五、结语

       大容量锥形离心瓶的特殊外形设计，无论是用于角转头还是水平转头中工作，离心生成沉淀的分布集中，既方便倾尽上清又便于完整回收沉淀。RCF5000×g以内的中低速离心应用环境中，采用Corning、Falcon锥形瓶比常规平底离心瓶的成本优势更显著，且简便易行。

       而当锥形瓶用于细胞器差速离心分离、大规模质粒提取纯化、噬菌体提取等高达RCF 10000×g以上的离心实验时，需有立式大容量高速离心机、500mL-1L角转头及配套适配器支持，虽分离效果与平底离心瓶趋近，但操作较为繁琐。

       文献10研究项目中，实验者用Avanti J-E落地离心机的JLA-16.250（或JA-14）角转头，在250mL平底离心瓶以15000×g RCF工作转速实现对培养菌体碎片的有效分离。这验证了本文开头的论点：角转头中离心时，平底离心瓶具有与锥形瓶同等离心效果。

参考文献

［1］Arthur Colson, Christophe Louis Depoix, Corinne Hubinont, et al. Isolation of Primary Cytotrophoblasts From Human Placenta at Term. Bio Protoc. 2021; 11(19): e4185.

［2］Ryoko Inaki, Yoshihiko Sato, Daisuke Nakamura, et al. Lipoaspirate stored at a constant low temperature by electric control suppresses intracellular metabolism and maintains high cell viability. Regen Ther. 2023; 24: 662–669.

［3］Jianlong Wang, Alan B. Cantor, Stuart H. Orkin. Tandem Affinity Purification of Protein Complexes in Mouse Embryonic Stem Cells Using In Vivo Biotinylation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 2009; CHAPTER: Unit1B.5.

［4］James P. Shellhammer, Elizabeth Morin-Kensicki, Jacob P. Matson, et al.   Amino acid metabolites that regulate G protein signaling during osmotic stress. PLoS Genet. 2017; 13(5): e1006829.

［5］Grant C Weaver, Rina F Villar, Masaru Kanekiyo, et al. In vitro Reconstitution of B Cell Receptor Antigen Interactions to Evaluate Potential Vaccine Candidates. Nat Protoc. 2016; 11(2): 193–213.

［6］Andrew B. Kleist, Francis Peterson, Robert C. Tyler, et al. Solution NMR spectroscopy of GPCRs: residue-specific labeling strategies with a focus on 13C-methyl methionine-labeling of the atypical chemokine receptor ACKR3. Methods Cell Biol. 2019; 149: 259–288.

［7］Vladimir N Noskov, Ray-Yuan Chuang, Daniel G Gibson, et al. Isolation of circular yeast artificial chromosomes for synthetic biology and functional genomics studies. Nat Protoc. 2011; 6(1): 89–96.

［8］Smaranda Craciun, Emily P. Balskus. Microbial conversion of choline to trimethylamine requires a glycyl radical enzyme. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012; 109(52): 21307–21312.

［9］Gregory A. Phelps, Martin N. Cheramie, Dinesh M. Fernando, et al.  Development of 2nd generation aminomethyl spectinomycins that overcome native efflux in Mycobacterium abscessus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024; 121(2): e2314101120.

［10］Aftabul Haque, Nicholas K. Tonks. Use of Phage Display to Generate Conformation-Sensor Recombinant Antibodies. Nat Protoc. 2012; 7(12): 2127–2143.

［11］Jeffrey M. Schaub, Chia-Wei Chou, Hung-Che Kuo, et al. Expression and characterization of SARS-CoV-2 spike proteins. Nat Protoc. 2021; 16(11): 5339–5356.

［12］Sean M. Crosson, Peter Dib, J. Kennon Smith, et al.Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation. Mol Ther Methods Clin Dev. 2018; 10: 1–7.