雷霆收罢江海凝——Optima MAX-XP超速离心机转头的选择对外泌体分离效果影响的分析

（前续：Optima MAX-XP台式超速离心机在外泌体分离中转头的运用）

        术语“外泌体”本意是指细胞外囊泡EVs中直径范围40-150nm的小直径颗粒亚群(sEVs)。其中既有体积大小接近的微囊泡、外泌体，也有源自不同亚细胞区室的外泌体。囊泡中内核酸含量及组成并不相同。相同RCF及时间设置下，不同转头类型、型号，所分离的沉淀中、150 nm, 120 nm, 100 nm和70 nm直径囊泡的组成比例存在差异。此外，不同转头对颗粒直径接近但浮力密度（浮力密度有关概念可参考《试析近垂直转子在超速离心中的应用-下》中“2.2 NVT转头应用的独特效率优势”部分内容）分布不同囊泡群的沉淀效能不同。研究表明，用目前广泛采用的100000-110000xg下4℃超速离心方法获得的脑组织来源的EVs沉淀物，经进一步蔗糖或碘沙醇密度梯度离心后，可分离出多达8个浮力密度组分。
       不同转头及工作设置下进行的超速分离的外泌体的产量、组成和污染物含量存在不确定性。对此，早已引起学界的关注。
        要理解超速转头是如何影响外泌体分离效果，需要从转头的工作原理这一源头说起。

1、不同转头类型内部RCF分布和样品组分沉降迁移路线的区别
1.1 转头内部RCF强弱分布不同对样品组分分离效果的影响

       做圆周运动物体所受的离心力F计算公式为：

       F = m ·ω2/r  ······················································ (1)

       公式中，ω为圆周运动的角速度，r为圆周远动半径。                                              

       离心机行业中，转头转速N规定用每分钟转头转动多少圈 (ration per minute，RPM) 来表示。N转速与转头角速度ω间的换算关系为

：ω = 2π·N/60  ···················································· (2)

       由此得到转头离心力与离心机转头转速N的计算公式：

F = m · π2 · N2 · r/900  ···············································(3)

       业内规定用物体在离心场中的离心加速度与在重力场中重力加速度（g=9.8米/秒）的倍比值，即相对离心加速度与相对离心力场（relative centrifugation filed, RCF），来反映物体的离心作用强度，即：

RCF = F/m · g   ···············································(4)

       将长度单位米统一转换为厘米，可得到以下离心机转头RCF计算公式：

RCF = 1.118 · 10-5 · N2 ·ｒ(×g)  ···············································(5)

       公式(5)表明：
        1）RCF强度值与离心半径相关
        不同转头Rav离心半径不同，转速N相同，但转头RCF并不相同。
        2）转速N变化对RCF影响明显
        转头转速增加使RCF呈现指数级增长。转速越高，转头内部不同位置的RCF差距更大。

       3）同一转头内部不同位置离转轴距离不同，RCF强弱不同。
       无论角转头、近垂直转头或水平转头，离心机转头内部不同位置的RCF强度分布存在差别。通常，离心管口内侧的离心半径最小、RCF最小；管底外侧的离心半径最大故RCF最大。整体上，离心管上半部离转轴较近，该区域RCF整体小于离心管的下半部。

       同一质点沿着离心半径方向移动，所受离心力大小由所在位置的离心半径决定。半径大，所受离心力大，克服溶液内部各种阻力离心方向水平迁移的驱动力大，沉降速度快。若以离心管中心点引出的水平线为界，从管口到分界线的前半段，细胞碎片、细胞器和细胞外囊泡等样品颗粒所处环境RCF强度整体上低于RCF设定值，故此阶段沉降速度较低、对不同浮力密度小、直径小颗粒的沉降能力效率低。越过分界线后，所处环境RCF整体高于RCF设定值，对样品组分中密度较小、直径较小的颗粒沉降效能增强，各种颗粒迁移速度增加，并在触壁后沿着管壁滑降至管底Rmax位置形成沉淀混合物。
       因此，不同转头虽然RCF设定相同，但内部RCF强度分布不均衡、不一致。同种样品颗粒在不同转头中沉降速度的变化过程是复杂的。转头对不同密度、直径尺寸的颗粒沉降效能的差异是客观存在的。这使得离心管内组成、密度和体积大小不同的样品组分，当所承受的离心力强度与各自沉降所需离心力匹配时，将不可避免地与实验目标样品组分发生共沉淀。
       公式(5)还表明：转头的Rmax与Rmin值之间的差距大，则管内RCFmin – RCFmax间跨度大，离心管内发生共沉降的组分越复杂；转头Rmax与Rmin值差距越小，内部RCFmin – RCFmax跨度越小，转头沉淀组分则越“单纯”。

       研究表明，在相同RCF、离心时间设置条件下进行的细胞外囊泡沉降实验所生成的沉淀物中，不同转头所沉降的的囊泡大小尺寸覆盖范围不同。SW 40 Ti和SW 28两个水平转头的Rmax与Rmin差距大，同等离心设置下，沉淀物中囊泡的大小尺寸从25 – 300nm不等，构成复杂。而TLA-110转头沉淀中囊泡大小尺寸构成相对简单，主要以50-100nm直径的小囊泡为主。因此，而Rmax与Rmin差距的大小一定程度上，可视作样品沉淀组分纯净度的指示器。

       在外泌体分离实验中，若要扩大囊泡尺寸覆盖范围，宜采用Rmax/Rmin比值较大的水平转头。而要缩窄囊泡尺寸覆盖范围，特别是想重点关注和提高100nm直径以下的外泌体分离纯度，则垂直转头、近垂直转头和倾角更小的角转头比使用水平转头会更有效。

1.2 转头类型差异决定着样品组分迁移路径的不同

        要实现所有组分颗粒的完全沉淀和完整回收，须等管口内侧样品颗粒迁移到管底才行。不同转头，样品离心过程中沉降迁移路径和路线长度不同。
       首先，转头单管的容量不同，通常适用离心管的管内径、工作长度不同。管容量大，管长度长，样品沉降路径长，有效离心时间相应更长。
       其次，对比水平转头和角转头可见，管口处样品颗粒沉降的路径方向不同：水平转头内样品迁移沉降方向始终水平指向管底。而角转头中样品颗粒先是在离心力作用下水平迁移沉降，触壁后在管壁处聚集成成更大的颗粒，随着颗粒继续增大和离心力沿管壁方向分力的推动下，克服管壁摩擦阻力和溶液阻力沿着管壁下沉，直至最大离心半径处形成致密沉淀。
       不同转头、不同工作容量离心管中，样品沉降路径的差异，造成样品沉降时间存在区别。通常认为，垂直转头和近垂直转头沉降时间较短，而角转头次之，水平转头沉降路线最长，速度最慢，用时最长。
       有效离心时间的差异，一定程度上影响到各种转头对样品组分的离心产量。原因在于，离心管的前半段溶液中RCF强度较低区域，部分样品组分因沉降速度较低，无法在设定时间内 “归队”而造成损失，降低了转头的样品回收率。特别是外泌体沉淀重悬清洗去除蛋白污染组分步骤，采用样品回收率更够高的微量角转头、近垂直转头，可提高外泌体，特别是小直径外泌体囊泡的回收率、减少损失。 

2、转头工作容量对离心效能的影响

       转头工作容量影响样品分离效能是因两方面原因造成的。

       2.1 转头本身几何结构设计因素

表5  100000×g RCF设定条件下转头容量与离心效能参数列表

       表5中的RCFmin代表在100000×g RCF设定下，转头最小离心半径处对应RCF。

       数据显示，无论是角转头还是甩平转头，转头单管容量从4mL增至39mL，转头Rmin变短的同时样品沉降距离变长，RCFmin降低和转头K因子值增大。RCFmin下降和样品沉降距离加长，使得有效离心时间要相应延长。否则，样品回收率要降低。

       在外泌体分离实验中排空培养基自带外泌体的环节，培养基体积大，所用转头单管容量（50-100ml）、转头整体样品容量也大，外泌体排空的离心时间越长。大量应用实例中，这一过程的离心时间长达15-18小时。而到外泌体沉淀阶段，样品体积不过2mL，相同RCF和温度设置，只需70min-2小时即可完成。因此，离心机条件许可情况下，优化培养基外泌体排空转头的选择，有利于提高效率和实验流程优化。

2.2 离心管样品装载体积的影响

       同一超速离心转头适用的多种不同额定容量圆底离心管，当管径一致时，则容量差异源于管长度的不同。将样品管载入转头时，通过添加相应管帽适配器，既为管顶部提供安全支撑，又确保离心管与离心孔底部的紧贴。

       以Optima MAX-XP台式超速离心机的MLA-55角转头（55000rpm/8×13.5mL）为例。它可使用容量范围、管径、长度、材质和款式不同的多款超速离心管，包括：

       13.5mL超净圆顶热封管（344322，φ16×76 mm）

       13.5mL薄壁超净开口管（344085，φ16×76 mm）；

       10mL厚壁透明开口管（355630，φ16×76 mm）；

       10.4mL带盖透明离心瓶（355603，φ16×76 mm）；

       10mL钟顶热封管（344622，φ16×67mm）；

       8.9mL指封管（361623，φ16×60mm）；

       6.3mL g-Max快封管（345830，φ16×44 mm）

       4.2mL g-Max热封管（356562，φ16×38 mm）；

       6.5mL薄壁超净开口管（344088，φ13×64 mm）

       4mL厚壁透明开口管（355645，φ13×64 mm）；

       2mL薄壁超净开口管（344091，φ8×49 mm）。

       其中，6.5mL薄壁超净开口管、4mL厚壁透明开口管和2mL薄壁超净开口管三种管径小于转头额定16mm直径标准，使用中须在管外加配管套适配器。单管套适配器的添加，使离心管中心整体上向内、向上偏移后，远离了转头最大离心半径（R_max）位置和最强RCF区域，造成样品整体RCF降低，离心效能下降。

       而6.3mL g-Max快封管、4.2mL g-Max热封管则不同。其管身外径与标准13.5mL管一致，使用时无需添加管套适配器。在管帽安装到位后，离心管底部始终紧贴离心孔的外壁和底部，管身整体上处于转头RCF最大区域。其样品分离效能自然高于使用管套适配器的离心管。此外，其管身短，样品组分沉降路径长度短，离心时间短。因此，g-Max管分离效能高于8.9 – 13.5mL标准尺寸和容量的离心管，实现少量样品在高转速、高K因子值而容量较大的转头中离心，充分利用优势资源，并极大提高离心效能。

       同理，容量相同时，厚壁开口管离心效能不及薄壁开口管和g-max管的工作成效。

       Beckman转头“大鱼吃小鱼”式设计优势在于，当无法获得参考文献中所使用的同款转头时，通过用速度较高、容量较大的转头配合小容量离心管使用，并优化RCF设置和离心时间设置，同样能获得理想的样品分离效果。

3、转头固定倾角大小与转头离心效能的关系

       固定倾角大小影响的是角转头和近垂直转头的分离效能。

       沉降离心时间的计算公式为：

Ts = (1/S)×2.54×10¹¹×1/N²×ln(R_max/R_min)  ···················································· (6)

       式中S代表特定样品组分在特定温度、溶液条件下的沉降系数。N为工作转速。当转头Rav相同或接近时，离心时间长短与R_max/R_min比值之自然对数值正相关。转头的倾角大，则R_max/R_min，Ts相应也大。

       此外，相同离心管安装于大倾角转头中时，离心管整体向转轴方向倾斜，管的上半部整体RCF小于倾角较小转头且样品水平沉降距离增大。故相同离心时间内，大倾角转头的离心效能低。

4、转头K因子值的基本概念与运用

       转头K因子（k-factor）又称k 系数，是业内为表征转头离心效能人为赋予的参数。它源于人们对样品在特定转头中最短离心时间的计算过程。

       对于特定转头，R_max/R_min比值是固定的。当转速N取转头最高转速时，则2.54×10¹¹×1/N²×ln(R_max/R_min)为一常数，人们将这一常数规定为k因子，即：

K = 2.54×10¹¹×1/N²×ln(R_max/R_min)   ···················································· (7)

       公式(7)表明：转头k因子值与工作转速、R_max/R_min有关。无论是因工作转速Neff降低或因转头R_max/R_min比值上升，均造成转头离心效能下降同时K因子值增大。而k因子值降低则宣示了转头离心效能提高。

       若规定K_eff代表工作转速Neff时的k因子值，K为转头最高转速N时k因子值，可得到k_eff 、K间换算公式：

k_eff = K×N/N_eff    ···················································· (8)

       这表明：转头工作转速高则k值低，转速降低则k值升高。

       对于特定型号转头，ln(R_max/R_min)是固定的，因此，确定了工作转速，就相当于确定了k_eff值。

       而根据转头的k因子值，即可评估转头离心效能高低（见表6）。 

表6 100000×g RCF值条件下超速离心转头工作参数

       数据显示，相同样品条件和相同100000×g RCF设置下，分离效能最佳的前5个转头为清一色Optima MAX-XP台式超速离心机适用转头，从高到低分别是：

       TLA-120.2（12×2.0mL）

       TLA-100.3（6×3.5mL）

       MLA-130（10×2.0mL）

       TLA-110（8×5.1mL）

       MLA-80（8×8.0mL）

5、根据转头工作效能确定外泌体超速离心分离的解决方案

       离心机驱动控制系统是以转头平均半径（Rav）作为有效离心半径，采用公式(5)的原理自动计算特定转速的RCF值，或依据实验者设定的RCF值计算并控制转头工作转速的。转头的分离效能，受离心半径、倾角大小、样品容量和离心管的选择等多重因素制约。仅仅关注FCR设置值大小，不足以有效、全面评估转头的离心效果。
       就外泌体分离实验而言，转头选型方案对外泌体的提取产量、品质和离心时间长短都有直接影响。在转头的选择和特定转头工作参数的优化调整上，可参考以下原则：
5.1 根据研究侧重点选择最适宜的转头
       当研究目标为整个细胞外囊泡群的构成及动态变化规律时，采用Rman/Rmin比值较大的水平转头或大角度角转头较为有利。当研究主要对象为中小直径囊泡时，则Rman/Rmin比值较小的垂直转头、近垂直转头及倾角相对较小的角转头是首选。
       要缩短外泌体离心操作流程所需时间，Rman/Rmin小比值类转头无疑较为理想。
       而针对外泌体密度梯度纯化分离，在时间条件允许时，单管容量3.5 – 13.5mL的水平转头或角转头都可以考虑。

5.2 根据自身转头条件优化调整离心参数
       外泌体超速分离中， RCF值设定明确后，为确保溶液中样品回收率和离心效率，对Rmin小的转头宜适度延长离心时间。同理，若采用相同离心时间设置，可优先尝试将Rmin较小转头的RCFmin适度提高，达到两种转头的RCFmin值接近的效果。或者引入g-max管，确保样品的RCF环境趋于接近。
       以单管容量均为39mL的MLA-50与Type 70 Ti两个转头为例：Type 70 Ti的Rmin和RCFmin大、K因子值小，故分离效能高于MLA-50。如参考方案是Type 70 Ti转头100000×g下离心70分钟设置，则多半采用了快速升降速模式设置。要用MLA-50转头来替代，则离心时间应适度延长。反之，若参考方案为MLA-50转头，而须用Type 70 Ti转头进行，则延长离心时间不必延长。

 （后续：Optima MAX-XP台式超速离心机在外泌体分离操作中时间的设定）