雷霆收罢江海凝——Optima MAX-XP台式超速离心机在外泌体分离流程中转头的运用

(前续：Optima MAX-XP台式超离在外泌体分离中的主要应用类型)

       《Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids》一文（即“基础流程1”，可参考《外泌体超速离心分离法基础操作流程 (译稿)》）中列出了多款适用于外泌体分离的立式、台式超速离心转头。
        其中，立式超速离心机适用的转头有：

       水平转头SW 41 Ti（6×13.2 mL）；

       水平转头SW 40 Ti（6×14.0 mL）；

       水平转头SW 32 Ti（6×38.5 mL）；

       水平转头SW 28 Ti（6×38.5 mL）；

       角转头Type 70 Ti（8×39 mL）；

       角转头Type 45 Ti（6×94 mL）。

       台式超速离心机适用的为：

       角转头TLA-100.3（6×3.5 mL）；

       角转头TLA-110（8×5.1 mL）。

       单管容量39mL、94mL的角转头用于对大量CM培养基自带外泌体的排空处理。38.5mL容量转头常被用来替代高速离心转头执行10000×g下细胞碎片/较大微囊泡/凋亡小体沉淀的任务。SW 41 Ti和SW 40 Ti水平转头主要用于13.5mL体积上清的第一轮100000×g离心操作。
初始材料体积在5mL以内的分离实验，则在台式超离上用3.5 mL、5.1 mL两种转头完成两轮超速离心、密度梯度纯化分群处理。相较于1.5mL、2.0mL的微量管，3.5 mL、5.1 mL两种超速离心管的管身长，梯度液柱长，特别是对包含多个密度组分梯度纯化操作中，各密度馏分间距较大，收集时对移液操作的精细程度降低，更方便。其次，这两款转头分离效能高，且可完美兼容1.5 - 2.0mL超速管，故使用上更高效灵活。

1、在外泌体超速离心分离流程中转头的使用方法

       对应初始材料体积5mL以内的实验流程，可在台式超离上借助于3.5 mL、8×5.1 mL转头完成两轮超速离心、密度梯度纯化分群处理（相较于1.5mL、2.0mL的微量管，3.5 mL和5.1 mL超速管，管身长，梯度液柱长，特别是对包含多个密度组分梯度纯化操作中，馏分分布间距较大，收集组分时对操作精细程度降低，更为方便。其次，是所列这两款转头分离效能高，且可完美兼容1.5 - 2.0mL超速管。故使用上更加高效灵活）。

调研收集的63个外泌体分离应用实例中，明确注明超离转头型号、可查实转头型号的为37例。所用转头单管容量最小1.5mL（LTA-55），最大94mL（Type 45 Ti）。

       多数报道用Optima MAX-XP台式超离单一转头完成外泌体分离。譬如，对肿瘤细胞分泌的外泌体分离实验中，细胞外液经历500×g离心10分钟、2000×g离心10分钟和10000×g离心45分钟后。用MLA-130角转头4℃下120000×g离心上清70分钟完成外泌体分离。在对源自年龄相关性黄斑变性(AMD)患者特异性视网膜色素上皮细胞（RPE）摄取细胞外囊泡（AMD RPE EVs）的共聚焦显微分析实验中，将事先分离获得的20μL AMD RPE EVs，加入1.2 mL DPBS，用TLS-55水平转子4℃下130000×g离心1小时完成沉淀。而为评估脂肪衍生的细胞外囊泡（EVs）在肥胖代谢紊乱中对脂肪因子分泌失调的作用。从代谢综合征患者外周血的血浆分离微囊泡（MVs）和外泌体（EXO）。20mL全血以260×g离心15分钟后，将富血小板血浆（PRP）与全血分离，并在1500×g下离心15分钟，得到无血小板血浆（PFP）。将PFP以21000×g离心45分钟以沉淀MV。将MV耗尽的PFP Optima MAX-XP超速离心机转子MLA-50以100000×g分离EXO。在100000×g下两次1小时以分离EXO。

       另外，有5个实例中的外泌体分离流程中，既使用Optima MAX-XP台式超离转头，也用到SW 40 Ti (6×14 mL)、SW 41 Ti (6×13.2 mL)、Type 70.1 Ti (12×13.5 mL)、Type 70 Ti (8×39 mL)、Type 50.2 Ti (12×39 mL)和Type 45 Ti (6×94 mL) 这些配属于Optima XPN-100、Optima-LE 80K等立式超速离心机转头。3.1.6 牛奶外泌体分离和3.1.8酵母菌外泌体分离纯化流程即属于此情况。

       事实上，以细胞培养基为起始材料分离外泌体流程中，使用中等容量超速转头会带来极大便利。如为检测前列腺癌患者血清中前列腺基质细胞衍生囊泡内的mRNA。研究人员从患者基质组织活检来源细胞培养基和外周血清进行了外泌体分离。1）以细胞调节培养基为起始材料的流程中，超速离心用的是立式超速离心机Type 70 Ti角转子、38.5mL快速密封管以100000×g离心2小时的方法。2）而1 mL患者血清样品，是先用大小排阻色谱法分离EVs，再将所有EVs的馏分合并，转移至5mL快速管在TLA-110角转子中100000×g离心2小时完成的分离。

2、Optima MAX-XP台式超速离心机在外泌体分离应用中转头的使用情况

       将37个实例中所有立式超离专用的转头，按工作容量等效方法转换为Optima MAX-XP台式超离转头，会更便于我们直观了解从常规样品材料分离外泌体所用转头的大致情况。因台式超离无法配置单管容量50 mL - 100mL大容量转头，故6×94mL的Type 45 Ti转头只用最大容量6×32.4mL的MLA-50替代。

表3 外泌体超速分离中立式-台式超离转头的相互替代对应表

        “基础流程1”中推荐的转头以Optima MAX-XP台式超速离心机转头表示，得到的转头清单是MLA-50、MLA-55、TLA-110和TLA100.3。这说明Optima MAX-XP台式超速离心机基本满足常规外泌体超速分离操作所需的转头容量、离心力指标工作要求。

       将这37例文献报道中实际使用的立式超速离心机转头转换处理后，各转头的使用频率如图3所示。                                              

       统计显示，这37个应用实例中的转头清单与“基础流程1”对比后，最显著区别在于：使用最多转头是MLA-55 (8×13.5mL)、TLA-55 (12×1.5mL)和MLA-50 (6×32.4mL)。

       排第二梯队的TLA-120.2 (12×2.0mL)、MLA-80 (8×8.0mL)与TLA-100.3 (6×3.5mL)，使用频率高于TLA-110。

       MLS-50和TLS-55这两款水平转头，在外泌体分离流程中应用频率分别明显不及同等容量范围的TLA-120.2、MLA-80与TLA-100.3，主要原因在于这两个水平转头转速、分离效能均不如第二梯队三个转头。

       如要为Optima MAX-XP台式超离在外泌体分离应用制定应用套装，MLA-50 (6×32.4mL)+ TLA-100.3 (6×3.5mL)无疑是一套效率灵活的组合方案。

3、Optima MAX-XP台式超离在外泌体分离中离心参数的设置

       “基础流程1”中，外泌体沉淀操作所用的离心力有2个：100000×g或110000×g。说明这两种离心力下4℃离心1小时所得到的外泌体组分，通常可以满足下游表征分析和检测对外泌体的产量和品质的要求。

       63个应用实例中，有28例外泌体沉淀步骤设定的RCF值为100000×g，7例设置为110000×g，12例用的是120000×g（含118000×g一例），另外13例设定的RCF从130000 - 259000×g不等，另有两例未标示RCF设置。

       “基础流程1”离心时间要求为：在转头稳定地实现设定离心力指标下持续离心满60分钟；仪器离心时间则按不低于70分钟来设置，以保障有效工作离心力下样品分离时间。延长离心时间到3小时不会对外泌体结构造成损伤。

       有效离心时间与仪器离心时间设定之所以存在区别，是因所有转头满负荷运行时，由静止到加速至100000-110000×g工作状态以及从工作转速减速直至停止运转，即便以最快升降速模式，则一升一降的过程耗时超过约10-20分钟。转头工作转速越高、样品体积越大、加减速设置越平缓，转头启动和刹车过程时长更长。将加减速过程所占用时间计算在内，设定的离心时间必然超过70分钟。

       统计显示：63个应用实例中，30.2%的项目离心时间设定为70分钟，25.2%的实例设置为2小时，不到20%的实例用的是60分钟时长方案（未说明原因）。达到或超过3小时设定者不到5%。可见超过50%的实例离心时间设定范围为70 – 120分钟。

表4 外泌体沉淀步骤离心时间设定值与实验案例数统计

       “基础流程1”中所有离心步骤全部在4℃下进行。63个实例的温度设置情况是：28例为4℃，有3例分别为8℃（脑脊液细胞外囊泡分离）、10℃（从PVA海绵植入物中分离EVs）和25℃（小分子化合物–外泌体结合率检测）。剩余超过半数实例未载明离心温度条件。

(后续：Optima Max-xp超速离心机转头的选择对外泌体分离效果影响的分析)