雷霆收罢江海凝——Optima MAX-XP台式超速离心机在外泌体分离操作中时间的设定

（前续：Optima Max-xp超速离心机转头的选择对外泌体分离效果影响的分析）

       用差速离离心方法从不同功能状态活细胞群来源的细胞外囊泡群中分离外泌体，是常用的的外泌体分离方法。差速离心的实现依赖于样品颗粒的沉降属性。在设定的RCF环境下，离心机转头内部RCF分布不均衡，多数情况下，离心沉淀组分中，均不止直径40-150nm的外泌体，往往还夹杂直径100-300nm的其它EVs组分。离心沉淀中组分构成不同，是导致不同研究数据差异的重要原因。不同离心时间，样品管内不同大小、组成、密度的颗粒发生共沉淀难以有效避免。研究表明，沉淀物中外泌体和脱落囊泡比例、非囊泡类生物大分子的构成比例有时间依赖性。
目前，对外泌体的发生起源、功能作用尚处于探索阶段。超速离心时间的设定，在实践中尚无严格统一标准。而超速离心时间选择，不仅关乎实验结果的可重复性，还对整体实验工作进程有直接影响。我们有必要来探讨外泌体分离流程中的超速离心时间如何设置这一复杂问题。

1、外泌体分离中影响时间设定的转头因素

       样品离心沉淀所需时间（沉降时间）主要由样品组分在特定条件下的沉降系数、工作转速和特定转头的Rmax与Rmin比值三个因素决定。用公式可表述为： 

T_s = (1/S) • (1/ω² ) • ln(R_max/R_min)  ······················································· (9)

       规定K因子值的定义后，公式(9)可转变为：

T_s = k/S   ······················································································· ·················· (10)

       样品组分的沉降属性与自身密度、溶液温度和粘度有关。高浓度蔗糖溶液、添加血清的培养基环境下，细胞外囊泡、细胞器沉降速度会降低。

       公式(10)表明：在样品条件相同情况下，离心时间长短与所用转头的k因子值大小有关。K因子小，沉降时间短；K因子值大，沉降时间长。
有研究证实：水平转头之间，根据转头各自有效k因子值的对比关系来优化调整有效离心时间，可取得较一致的分离结果。但此方法不适用于角转头之间离心时间的调整。
       外泌体超速分离中，为确保溶液中样品回收率同时兼顾离心工作效率，运用转头K因子值与沉降时间的关系原理，调整离有效离心时间是意义的：对R_min较小的转头宜适度延长离心时间；若采用相同离心时间设置，则可尝试将R_min小的转头宜适度提高RCF值，如从100000×g调整为110000×g。
       以单管容量均为39mL的MLA-50与Type 70 Ti两个转头为例：Type 70 Ti的R_min和RCF_min大、K因子值小，故分离效能高于MLA-50。如参考方案是Type 70 Ti转头100000×g下离心70分钟设置，则多半采用快速升降速模式设置。要用MLA-50转头来替代则离心时间应适度延长。反之，若参考方案为MLA-50转头，而采用Type 70 Ti转头进行，则延长离心时间不必延长。
       离心时间设置，不能仅考虑样品组分有效沉降时间，还须结合实际所用转头升降速过程占用时间的差别。

        转头运行时间分为启动加速、稳定运行和刹车减速三个阶段。而样品有效沉降时间只相当于剔除加速、减速两个阶段后转头持续稳定在设定转速或RCF状态运行的时间。超速离心的设定时间，除了样品所需的有效沉降时间，还需将转头加减速阶段耗费时长纳入考虑。即：超速离心设定时间要大于样品沉降所需时长。
        不同型号超速转头的自重不同、空载与满载情况下，转头加减速过程所需时间不同。转头负重大，加减速耗时长。此外，设定的工作转速高，加减速耗时长，则设定离心时间要相应延长（见表7）。

表7  Beckman Optima台式、立式超离转头满载情况下加速、减速时长列表

（工作转速值参考离心力-转速在线换算工具https://novopro.cn/tools/g-force-rpm-convertion.html计算结果得出）。

       数据显示，转头满载并以最快速度加减速时，多数转头加速慢而减速快。
       但最快升降速模式并不适用于所有转头类型、离心管、样品载量和应用方法。无论角转头或水平转头，使用无盖开口管且样品满载状态下，启动和刹车宜尽量平缓以避免启动刹车过猛引发样品外溢损失。而用垂直转头、近垂直转头和角转头密度梯度离心，平缓减速或转头自由减速，可避免已完成分离梯度液层混合风险。

       Beckman超离心内置有超平稳控制功能（Ultra Harmonic Technology, UHT），是通过内置UHT程序控制转头升降速的速度变化曲线。以Optima MAX-XP为例，加减速过程设置有10档升、11档降的UHT控制程序可选（见表8）。

表8 Acceleration and Deceleration Rates

       加速ACCEL控制程序分别用数字1-9和无数字表示共10档，而减速DECEL控制程序分为0-9和无数字共11档。超速离心的加减速过程控制各分为两个阶段：0-5000rpn阶段和5000rpm – 设定转速阶段。无论升速、降速，5000rpm-工作转速阶段，系统均以系统默认的最快速度进行不受人工干预。而0-5000rpn低速阶段，则由ACCEL\DECEL程序调控。数字代码从1至9，转头升降速的时间以30秒-1分幅度递增。1档较短，9档最长。0档为自由落体式减速耗时超过10分钟。不输入档位代码数字，则转头从0-设定转速的全过程均以最快变速完成升降速过程。

       数据表明，仅0-5000rpm这一过程一升一降两个阶段各取中位数累计时间就长达5分半钟。再将5000rpm至设定工作转速（如设定为30000rpm）最快变速阶段时间，则升降速过程耗时至少在7分钟以上。这一点从表7提供的转头升降速时间看，实际超过10分钟。

       因此，为确保样品有效离心时间不低于60分钟，“基础流程1”建议在满足100000×g RCF的条件下超离时间设置为60+N分钟，N值大小对应的正是转头的加减速时长。

2、外泌体超速分离流程中离心时间设置存在的争议
        在已报道的63个实例中，27例的时间设置为70-90分钟，多达16例的设置为120分钟，3例为3小时，还有1例是4小时的设置。其中，转头型号可查实的37例中，所用转头与时间设置情况见表9。表中编号213、229、106、273的不同实验，工作温度、缓冲液、转头（TLA-100.3）、主机和RCF设置都相同，而离心时间竟出现了120 min、240 min、60 min和70 min四种设置。

表9 部分文献中外泌体超速离心时间设置与转头工作参数表

       表中相同RCF设置下，离心时间60--120min不等的现象极为常见。可见，关于离心时间设置问题，学界并无一致意见。

       不同实验项目中，造成离心时间差异悬殊，是由实验样品本身和外部离心条件的内外因综合作用的结果。

       首先是外因方面，不同型号转头、相同RCF设置下分离效能存在区别是不争的事实(见表10)。单管样品容量均为39mL的5款转头TYPE 70 Ti、TYPE 50.2 Ti、VTi 50.1、SW 32 Ti和SW 28之间，在相同118000×g的RCF设定下，离心效能最高是VTi 50.1，其次是TYPE 70 Ti、TYPE 50.2，水平转头SW 28垫底。若TYPE 70 Ti有效离心时间为60分钟，从k因子值大小这一常识即可推定SW 32 Ti和SW 28连个水平转头有效离心时间远超60分钟。

表10 不同类型转头在118000×g RCF设定下转速-K因子值-沉降时间表

       具体实验中，如SW 32 Ti转头4小时离心时间收获的样品组分与TYPE 70 Ti转头70分钟、VTi 50.1离心50分钟外泌体产量达到了相同分析效果是极为正常的。另外，衡量外泌体产量的所用方法同样十分关键。提取离心沉淀中总RNA含量用Bioanalyzer 2100检测而非实时荧光定量PCR方法，其测试数据特异性存疑。Western Blot无法区分体积较大的细胞外囊泡、凋亡体、外泌体以及死亡细胞解体所释放的TSG101蛋白。

       “基础流程1”提到了离心3个小时无损外泌体囊泡结构。所谓过犹不及，离心时间并非越长越好。延长离心时间，将使富含蛋白质的囊泡颗粒及可溶性蛋白质等非囊泡类组分的聚集沉淀，加剧外泌体中蛋白污染程度。对此，目前学界的看法是有共识的。因此，外泌体含量评价方法存在缺陷情况下界定的外泌体产量，不足为据。

      其次，外泌体的分泌是一动态过程，它与细胞自身功能状态、培养基中自带外泌体排空以及培养条件密切相关。不同实验所用细胞自身活性、功能状态以及培养处理条件的差别，造成细胞外泌体的分泌效率存在区别。若无细胞生理功能状态特定指标的支持，仅凭培养基中细胞数量基数评估外泌体提取产量，结果值得商榷。

       不应轻易得出外泌体分离时间以4小时之内为宜，70分钟离心时间无法分离出外泌体无效的结论。

       特定 RCF设置下外泌体离心时间、囊泡直径大小截止范围（cut-off）的技术工具的出现以及大量文献实例证据，都不足以支持70分钟离心时间无效的观点。

3、外泌体超速分离离心时间的设置原则与方法
       关于外泌体超速离心分离流程细节信息的汇报，MISEV2018指南除了要求披露实验所用转头型号、样品管、RCF设置、k因子有效值、离心时间和离心温度等要素，还需提供转头加减速设置参数。可见，离心时间设置离不开所用的样品体积、转头工作性能条件。
       转头的选择需要遵循两个原则：
1）研究对象相似
       不同来源样本材料、不同生理病理状态下的细胞分泌的外泌体种类、数量存在差异。因此，从初始样品材料相同或相近的外泌体研究参考文献中，筛选出对超速离心流程的离心时间、RCF设置、温度和转头型号、离心管货号及转头加减速信息披露完整的实例，摘录其实验参数条件。其中，离心时间、RCF设置和转头型号信息必不可少。
2）转头性能相近
       当转头型号与参考方案中不一致时，按转头型号——类型——样品容量的优先顺序，选择与参考转头效能匹配的超离转头。
       外泌体超速分离实验中，不可脱离自身条件，简单照搬参考文献的时间参数设置。这不仅浪费资源和时间，还可能危及外泌体分离结果。工作参数优化调整方法，可参考《Optima MAX-XP超速离心机转头的选择对外泌体分离效果影响的分析》中“根据转头工作效能确定外泌体超速离心分离解决方案”一节内容。
       工作参数的调整有两个途径。一是优化离心时间，二是优化RCF设置。
       当RCF值明确后，为确保样品回收率和离心效率，对R_min小的转头宜适度延长离心时间。以Optima MAX-XP台式超速离心机用的MLA-50与Optima XE -90立式超离用Type 70 Ti为例。虽然均为单管容量39mL的角转头，但相同RCF设置下，Type 70 Ti具有较大R_min、RCF_min和较小K因子值，其分离效能高于MLA-50。如参考方案为Type 70 Ti转头4℃下100000xg离心70分钟设置，用MLA-50转头替代时，离心时间适当延长是必要的。反之，若参考对象是MLA-50，而实验者用Type 70 Ti，则延长离心时间意义不大。
       外泌体分离的品质与转头内部RCF分布有关。为确保离心管内RCF条件接近，考虑到MLA-50和Type 70 Ti之间R_min的巨大差异，单纯用相同RCF设置不够，还应考虑将MLA-50转头RCF_min调整至与Type 79 Ti相近的水平。计算表明，Type 70 Ti转头若设定为100000xg RCF，则将MLA-50转头的RCF设置提升至123600×g后，两个转头中离心管的中上部位RCF的分布条件比较接近，有助于获得与Type 70 Ti转头接近的分离效果。

(后续：台式超速离心机Optima Max-XP在外泌体分离操作细节汇报中应注意的问题)