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雷霆收罢江海凝——Optima MAX-XP台式超速离心机在外泌体分离中应用的主要类型
（前续：Optima MAX-XP台式超速离心机是如何成为细胞外囊泡分离神器的？）
外泌体（small Extracellular Vesicles/sEVs；习用名exosome/EXO）是由细胞内多泡内体(multivesicular endosome, MVE)与细胞膜融合后通过胞吐作用释放到细胞外、直径30 - 150nm的小型囊泡。外泌体、微囊泡（medium EVs /mEVs；习用名microvesicle, MV）和凋亡小体（large EVs / lEVs; 习用名apoptotic body/AB）共同组成细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）群。外泌体可由造血细胞、B细胞、T细胞、树突细胞、神经元、和肠上皮细胞等所有类型的真核细胞释放，遍布于血浆/血清、羊水、腹水、乳汁、尿液、关节腔积液、脑脊髓液及细胞培养基等各种生物体液中。
外泌体携带源自其亲本细胞的膜质和细胞质成份。磷脂双层膜中嵌入了源自亲代细胞的蛋白质和脂质。四跨膜蛋白CD9、CD63 和CD81及肿瘤易感基因101 蛋白(TSG101)被视为外泌体管家标记。囊泡内包含如β-连环蛋白ADP-核糖基化因子(ARF) 1、表皮生长因子受体(EGFR)、粘蛋白1 (MUC1)、磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)、mRNA、microRNA（miRNA）、长非编码RNA（lncRNA）、及脂质相关蛋白和磷脂酶等多种参与信号转导的分子。外泌体囊泡膜上的表面受体能被局部或远程的受体细胞靶向并捕获。外泌体与受体细胞结合后，可通过吞噬作用或与细胞膜直接融合的方式释放囊泡内容物，完成细胞间调控信息的传递。
1、多种外泌体分离方法中超速离心技术的地位
对外泌体表面受体、内容物和与细胞功能的研究，首先要分离出足够数量和纯度的外泌体成分。外泌体囊泡作为纳米尺度的微粒，无法通过常规滤膜过滤方法截留。胞外囊泡体型远小于细胞（10-30 μm），而不同亚型的细胞外囊泡在离心场中具有不同的沉降速度。通过差速离心，就可将外泌体与样品溶液中的蛋白质、微囊泡、凋亡小体、细胞及细胞碎片分离。国际细胞外囊泡协会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEVs）2016年10月份发布的用于细胞外囊泡隔离和表征的技术的首次全球调查报告显示，超速离心是最常用的外泌体分离方法（但不支持“金标准”的提法）。
2、Optima MAX-XP台式超离在外泌体分离中的主要应用类型
截至自2023年8月底，从Pubmed期刊数据库中共采集到Optima MAX-XP台式超速离心机用于胞外囊泡分离实验、所发期刊2023年影响因子iFoid≥6.0的文章63篇。
依所用外泌体分离起始样品来源类型和流程差异，可梳理出至少以下9种代表性应用类型。
2.1 细胞培养基外泌体分离
2.1.1 培养细胞外泌体分离
先将收集到的190mL细胞调节培养基2500×g离心30分钟，除去细胞碎片和凋亡小体；
上清20000×g离心60分钟，分别收集沉淀所得的微囊泡组分、上清；
上清用容量12×39mL的Type Ti 50.2超速离心转头4℃下110000×g离心2小时，沉淀小囊泡；
收集的小囊泡经500μL PBS洗涤，用12×1.5mL容量的Optima MAX-XP超速离心机TLA-55角转头100000×g和4℃下离心2小时；
然后将MV、外泌体沉淀重悬于50μL DPBS缓冲液中和将未使用并经超离排空自带外泌体处理的对照培养基储存在80℃用于后续分析。
2.1.2 培养细胞外泌体分离和蔗糖密度梯度纯化
完整收集在无血清调节培养基中的培养物，在4℃下2000×g离心20分钟除去细胞碎片，收集上清；
上清用Optima L-80XP超速离心机6×94mL Type 45 Ti转头4℃下100000×g离心1.5小时；
沉淀经PBS洗涤，用Optima MAX-XP超速离心机MLA 80转头100000×g在4℃离心1h；
收集沉淀后重悬于100μL PBS中；
将100μL外泌体样品与1mL 60%蔗糖溶液混合后铺垫于超速离心管底部，再将1mL 30%蔗糖溶液和1mL PBS依次上样到样品顶部。在Optima L-80超速离心机SW 55 Ti水平转头中4℃下150000×g离心16小时；
收集每种馏分各1mL 并与6mL PBS混合以稀释溶液中的蔗糖；
用Optima MAX-XP超速离心机MLA-80转头150000×g离心1.5h，除去含蔗糖的上清，收集沉淀；
将沉淀重悬于100μL PBS中储存以备后续检测。
2.1.3 培养细胞外泌体分离和荧光标记
完整收集细胞调节培养基，经1000×g离心10分钟和2500×g离心25分钟除去细胞碎片和凋亡小体；
用6×250mL角转头将上清20000×g离心60分钟，富集MV组分，同时回收上清；
用Optima-LE 80K超速离心机Type 50.2 Ti转头将上清110000×g离心2小时沉淀外泌体；
将沉淀重悬于DPBS中-80℃并储；
制备未与细胞接触排空EVs的细胞培养基作空白对照；
将与亲脂性荧光示踪染料与外泌体孵育后的待测样品，用Optima MAX-XP超速离心机TLA-55转头110000×g离心1小时，除去未与EVs结合荧光染料；
用与EVs相同的超速离心方案进行稀释染料制备作为阴性对照。
2.1.4 培养细胞外泌体和结构与质谱分析
收集大鼠主动脉内皮细胞（EC）、血管平滑肌细胞（VSMCs）培养基，300×g离心10分钟；
2000×g离心20分钟以除去细胞碎片；
用Optima MAX-XP超速离心机MLS 50水平转头12000×g离心40分钟，沉淀去除大囊泡和凋亡小体，收集上清；
上清1100000×g超速离心70分钟，并分为两组；
收集的一组沉淀经PBS洗涤重悬后用0.2μm滤器过滤， 110000×g离心70分钟，用于透射电子显微镜或质谱分析；
另一组沉淀经PBS洗涤后，经2轮70分钟110000×g超离富集外泌体颗粒，重悬于 50–100μL PBS 中用于功能研究。
2.2 尿液外泌体分离
将50mL健康男性的尿液4℃下180x g离心10分钟以除去细胞；
再经1560×g、4℃离心20 分钟沉淀盐类结晶，收集上清，分成1mL等分-80℃储存；
将12个1mL尿液等分试样37℃孵育解冻后合并，1560×g、4℃离心10分钟除去析出盐类晶体；
上清用Optima MAX-XP超速离心机TLA-55转头154000×g，4℃下60分钟，沉淀外泌体；
沉淀经PBS洗涤重悬后，分成四等分储存备用。
2.3 脑脊液外泌体分离
将4mL脑脊液加入含有8μL RNase抑制剂的13×51 mm PA超速离心管中，用PBS调节至5 mL；
用Optima Max-XP 台式超速离心机MLS-50 水平转头在8℃下120000×g离心80分钟，减速设置为7；
将细胞外囊泡沉淀与8μL RNase抑制剂在42μL PBS中孵育用于提取RNA。
2.4 羊水外泌体分离
收集羊水去除细胞碎片，4℃下20000×g离心30分钟，收集细胞外囊泡(EVs)沉淀，并保留上清；
将EVs沉淀重悬于15μL PBS中；
上清转移到11×34mm离心管中，用Optima MAX-XP超速离心机MLA-130转头4℃下100000×g离心2小时，弃上清；
将沉淀重悬于1mL PBS，再次经超速离心，收集沉淀；
将两次富集的胞外囊泡沉淀合并后，重悬于PBS中，-80℃储存。
2.5 血液外泌体分离、表征和功能研究
2.5.1 血浆外泌体分离
将血浆分为两组：一组1mL 用于表征实验，另一组共4mL用于功能实验。每组等分样品用PBS稀释至7-8mL；
稀释后血浆转移至PC材质超离管（355630），用Optima MAX-XP超速离心机MLA-55角转头4℃下100000×g离心70分钟，沉淀sEVs；
弃上清，将sEVs于PBS（7-8mL）中洗涤后重悬，再次超离处理；
将sEVs的沉淀PBS重悬至最终体积100-200μL，-80℃下保存。
2.5.2 血清外泌体分离与质谱鉴定
6-8周龄SD大鼠经安乐死后左心室心脏穿刺收集血液并转移至15mL Falcon管静置60分钟；
10000rpm离心10分钟沉淀凝块，收集上清；
上清10000rpm离心10分钟，弃沉淀收集上清；
用等体积的PBS稀释上清并以12000×g离心以除去其中的细胞碎片；
以110000×g超速离心120分钟，沉淀EVs；
将EVs沉淀洗涤，重悬于PBS中
再通过四轮PBS反复洗涤-超速离心后，重悬于尿素裂解缓冲液中用于质谱分析。
2.6 牛奶外泌体分离
从山羊和奶牛养殖场收集新鲜山羊奶和牛奶样品；
将牛奶和山羊奶在4℃下3000×g离心30分钟以除去细胞碎片，细胞和脂肪，收集上清；
上清4℃下50000×g超速离心1小时，并用0.22μm过滤器过滤获乳清；
用Optima MAX-XP超速离心机MLA-150角转头4℃下110000×g离心70分钟，收集沉淀；
将沉淀重悬于1X PBS，重复一次超速离心；
将最终的沉淀悬浮在1×PBS中并通过0.22μm过滤器过滤后，-80℃储存备用。
2.7 腹水外泌体(ADE)的分离
先将采集的腹水300×g下离心10min，同时收集上清、细胞沉淀-80℃保存（用于后续细胞成分的免疫组织化学分析）；
将上清2000×g离心20分钟，并0.22 μm过滤器过滤；
用Optima MAX-XP离心机100000×g离心70分钟，将外泌体收集沉淀并溶解在PBS中，-80℃下储存。
2.8 真菌外泌体分离和碘沙醇密度梯度纯化
真菌细胞壁消化液过滤后，将12 mL样品加入14×89 mm超透明离心管；
用Optima XPN-100 超速离心机SW 41 Ti 转头4℃、10000×g离心 30分钟，去除菌体碎片；
用移液管将大部分上清(11.5 mL)转移到一支新离心管中，用新鲜0.7 M NaCl将体积补充至12 mL，4℃下60000×g离心90分钟；
用移液管除去11.5mL上清，将剩余的0.5mL沉淀重悬；
EVs重悬液转移到13×51 mm PC材质超速离心管中，用无菌 20 mM Tris-HCl pH 7.5补充至3 mL，用Optima Max-XP 超速离心机TLA100.3 转头4℃ 下40000×g离心60分钟；
弃上清留沉淀，并除去管上部3/4残留液体；
碘沙醇（Optiprep）不连续密度梯度液由40%，20%，10%和5%（v / v）四层组成。 将EVs颗粒重悬于1mL 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)中，并与2 mL 60% Optiprep混合以形成40%浓度层。其余密度层通过在 20 mM Tris-HCl pH 7.5 中稀释60% OptiPrep 储备溶液配制。依次将每层密度溶液3 mL加入14×89 mm超清离心管中形成梯度，从40%溶液开始，以5%溶液结束。样品管置于Optima XPN-100 超速离心机SW 41 Ti 转头中4℃ 下100000×g离心17小时；
去除顶部3mL溶液，收集余下六个馏分，每个馏分1 mL，转移至13×51 mm PC材质超速离心管中，用冰冷无菌 20 mM Tris-HCl将样品体积补充至3.5 mL；
在Optima Max-XP 超速离心机TLA100.3 转头中4℃ 下40000×g离心；去上清，将沉淀重悬于20 mM Tris-HCl中备用。
2.9 组织细胞外EVs分离
2.9.1 肿瘤组织中分离EVs
从口腔囊状细胞癌患者的肿瘤组织在清除残留血液后，将肿瘤组织切成碎片，并用添加胶原酶IV和DNase I的RPMI-1640培养基进行处理后，在37℃下振荡孵育1小时，将肿瘤组织细胞从细胞外基质中解离；
500×g离心10分钟，除去解离的组织碎片和单细胞沉淀，采集上清；
将上清转移到新离心管中，4℃下用2000×g RCF 10分钟、10000×g RCF 45分钟两轮离心，去沉淀留上清；
上清用Optima MAX-XP离心机MLA-130角转头4℃下120000×g离心70分钟，去上清；
收集沉淀并重新悬浮在PBS中保存。
2.9.2 脑组织外泌体分离和纯化
生物材料：12个月大的C57BL/6J雄性小鼠的右半脑或人的冷冻脑组织200-300mg。
将脑样品从-80℃冰箱移至干冰，从干冰直接移至培养皿。用单刃剃须刀片粗切成1-5mm的脑碎片，用移液器将粗切组织转移到含木瓜蛋白酶溶液的15mL锥形管中37℃消化15分钟；
4℃下300×g离心10分钟，收集上清；
上清用40μm网格过滤去除除细胞、碎片和未消化组织后，收集滤液；
滤液在2000×g下离心10分钟，去沉淀回收上清；
将上清转移到70mL PC超速离心瓶，加入冰冷PBS使总体积达到50mL；
用 Type 45Ti角转子4℃下10000×g 离心30分钟（11000rpm，k因子：2218），收集上清；
上清移液到另一个70mL PC超速离心瓶，4℃下100000×g离心70分钟，去上清；
将沉淀重悬于4℃ 50 mL PBS中洗涤；
再次4℃ 100000×g离心70分钟，去上清。
低分辨率蔗糖密度梯度纯化步骤：（略）
高分辨率碘沙醇密度梯度纯化步骤：
将EVs沉淀重悬于1.5mL冰冷40%（V/V）碘沙醇溶液中，将该溶液铺垫于14mL薄壁超透明管底部；
依次将1.5m不同浓度的碘沙醇溶液（先 20%，然后 15%，13%，11%，9%，7%）分层铺垫在EVs重悬液之上；最后将2 mL 5% 碘沙醇溶液作梯度液的顶部（14mL管从上到下，液体分层依次是2mL-5%，1.5mL -7%，1.5mL - 9%，1.5mL -11%，1.5mL -13%，1.5mL -15%，1.5mL -20%碘沙醇梯度液，1.5mL -EVs碘沙醇重悬溶液）
用Optima XE-90立式超速离心机水平转子SW 40 Ti（40000rpm，k因子值137）在 4℃下200000×g 离心过夜 16小时，低制动设置；
收集 1.25 mL顶部馏分1梯度液，转移至4 mL冰冷PBS 的6.5 mL厚壁PC管中；
收集馏分2 – 8各1.5 mL转移至 4 mL冰冷PBS的 6.5 mL厚壁PC管中；
称量馏分1-7离心管，用PBS填充至11.00±0.02g；
将馏分8分成两个管，用PBS填充填充至11.00±0.02g；
用MLA80转子(46000rpm,k因子57）或用70.1Ti型转子（40000 rpm，k因子94）在 4℃下100000×g 离心70分钟；
将各EVs密度馏分分别重悬于30μL冰冷PBS或30 μL AAB 中，以备后续BCA、蛋白质组学、转录组学、脂质组学和RNA分析。
3、小结
使用Optima MAX-XP台式超速离心机进行的外泌体分离实验中，最常用的起始样品材料是CM培养基培养的各种哺乳动物组织细胞，其次是外周血/血清、动物来源的实体组织（肿瘤组织、脑组织、肌肉等）、尿液、脑脊液、腹水、羊水和牛奶。酵母菌等非哺乳动物来源样品也见诸报道。
从分离流程看，大部分实例参考的是《从细胞培养上清液和生物体液中分离和表征外泌体》文中的UNIT 3.22一节的“Basic Protocol 1：Purification Of Exosomes By Differential Ultracentrifugation”部分（以下简称“基础流程1”）流程中描述的300×g——20000×g——10000×g——100000×g——100000×g五步差速-超速离心分离方法或一过滤二超离的替代方法。收集EVs沉淀直接用于电镜、Western Blot蛋白和核酸实时荧光定量PCR检测分析。
考虑到目前所用基础操作流程所得到的外泌体组分来源（除了胞质MVE来源的外泌体，还有亚细胞区室，如线粒体等来源的外泌体）、大小和功能的异质性，部分实例在两轮超速离心外增加一次蔗糖或碘沙醇密度梯度离心，将含外泌体粗提物沉淀（实质是密度不同小囊泡群）进一步分离，收集不同浮力密度区带的馏分，经第4次超离沉淀各密度馏分中外泌体颗粒的方法除去蔗糖上清，再收集外泌体用于各项表征分析。
然而蔗糖用作密度介质时有其固有缺点。首先是蔗糖溶液的渗透压高，除了0.25-0.3M 浓度范围蔗糖溶液渗透压（250-300 mOsm/L）与细胞内外液体基本等渗外，其他密度梯度层都是高渗压溶液。蔗糖梯度液高渗会造成细胞器、囊泡等微粒脱水而变形甚至失活。其次，摩尔浓度相似的蔗糖溶液分层后容易发生扩散混合，阻碍了蔗糖高分辨率梯度生成。因此，蔗糖在分离EVs亚群方面仅部分有效。
新型非离子惰性碘化复合物碘沙醇（iodixanol，Optiprep是Axis-Shield公司的注册商品名）溶液粘度低，并可在很宽浓度范围内配制成与细胞等渗的梯度溶液，不影响细胞的形态和活性。并且碘沙醇溶液粘度相对较低，可形成比蔗糖更窄的密度梯度，使得梯度介质具有很高的样品组分密度分辨率。实验表明，碘沙醇高分辨率密度梯度液所获得的总EVs产量与蔗梯度液接近，可区分胞质来源的外泌体和线粒体衍生外泌体（mitochondria-derived mitovesicles）。用碘沙醇取代蔗糖作为密度梯度介质纯化所得的外泌体，功能活性和形态结构保持完好，特别适合功能和电镜分析。
