雷霆收罢江海凝 —— 试析近垂直转子在超速离心中的应用-中

（续：试析近垂直转子在超速离心中的应用-上） 

1.3 蛋白组分分离

       NVT转头分离处理的蛋白样品类型繁多。若以细胞膜为界从空间上划分的话，有膜外来源的药物组分（如蜂毒素），有定位于细胞膜上的膜蛋白、激素和药物受体（如AChRs、雄激素受体）、LDL/HDL脂蛋白、蛋白脂质体（proteoliposome）、脂筏(lipid rafts)和菌体的胞膜成份，定位于胞内的Pak1-βPIX -GIT复合物、可溶性胞质蛋白（如淀粉样蛋白-β蛋白前体,AβPP），定位于细胞器质膜上的蛋白-RNA信号识别复合体SRP以及定位细胞核内的TOP1-DNA共价复合物、DNA复制转录有关的聚合酶β等酶类等。

       各种蛋白有不同的定位，如膜蛋白、胞浆蛋白、核蛋白、分泌蛋白及各种细胞器蛋白。蛋白的运输与加工定位信号肽（signal peptide）/信号序列（signal sequence）引导。识别和结合信号肽的为一种核糖核蛋白复合物，称为信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）。当SRP与新出现的信号肽结合时，它会诱导翻译延伸暂停并引导翻译复合体与内质网（ER）上的SRP受体结合。新生肽链通过SRP-ER连接的通道进入ER，被信号肽酶（signal peptides）切除。当内质网将信号肽切除后，蛋白翻译才能继续进行，并进行蛋白的折叠和修饰。

       真核生物的SRP由一个7S RNA及6个与RNA结合的蛋白质亚基组成。这六个蛋白分别命名为SRP9、14、19、54、68和72。目前已知的是，SRP9/14异二聚体用于在SRP54亚基与新生多肽链新信号序列相互作用时阻止蛋白质翻译。SRP19则促进SRP54与SRP RNA的附着。古菌SRP包含有7S RNA和两个SRP19和SRP54蛋白组分。 

       将嗜盐古菌(Haloferax volcanii)的SRP RNA，SRP19和SRP54三种纯化蛋白在37℃高盐溶液环境下单独或一起孵育重建SRP复合物。通过NVT转头蔗糖密度梯度离心与凝胶电泳相结合的方法，检查不同梯度离心条带中的各种复合物，以解古菌SRP复合物结构的组装机制。

       将孵育样品上样到在 50 mM MgSO4、5 mM DTT、50 mM Tris–HCl、50 mM Tris–HCl（pH 7.2）中制备的 40% - 10% 蔗糖梯度液顶部，用Beckman NVT65转子55000rpm、4℃离心4.5小时后。通过SDS–PAGE分析所收集的18个组分中的蛋白质、用2%琼脂糖凝胶电泳分析条带中的RNA。通过凝胶密度扫描确定每个条带组分蛋白（考马斯蓝标记）或RNA（溴化乙锭染色）的含量。

       实验结果表明，在1M KCl中制备的蔗糖梯度条带中，SRP19与SRP RNA的相互作用有限，但SRP54存在则可增强二者的结合。没有SRP19时，H.volcanii SRP54可与SRP RNA相互作用并在梯度离心中定位于同一条带。当SRP19存在时所有SRP54都可作为RNA-SRP19-SRP54三聚体复合物的一部分被检测到，且在SRP RNA-SRP54复合物中可以检测到大量SRP19。表明SRP19在古菌核糖核蛋白复合物中可能处于发挥增强SRP54结合的作用。提示SRP54与SRP RNA结合则很可能是SRP完全组装不可缺少的部分。

       DNA拓扑异构酶（topoisomerase, TOPs）因其拓扑异构酶抑制剂类(TOP1-ADC)抗肿瘤药物作用靶点身份而备受关注。基因组突变后错误的核糖核苷酸可以通过TOP1去除。但通过TOP1修复机制容易出错，并导致Top1-DNA共价复合物（Top1-DNA covalent complexes, Top1cc）形成。而DNA修复的缺陷会导致DNA损伤的积累，随之而来DNA损伤依赖性信号的传导是许多人类神经发育/神经炎症性疾病的神经变性的核心特征。

       核糖核酸酶H2（(Ribonuclease H2，RNASEH2）是一种基因组监视因子，可从DNA中去除错误结合的核糖核苷酸（称为核糖核苷酸切除修复）及R-环处理，对保持DNA 完整性至关重要。RNASEH2为包含有催化亚基RNASEH-2A、辅助亚基RNASEH-2B和RNASEH-2C亚基的异源三聚体复合物。其中RNASEH2B亚基介导了RNASEH2复合物和增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA）之间的相互作用，将RNASEH2B定位于复制病灶。RNASEH2B失活后，DNA复制中会频繁发生DNA双链断裂（double-strand break, DSB）且难以有效修复。

       Aicardi-Goutières综合征（AGS）被认为与核酸代谢有关的基因突变发生有关。其中，RNASEH2突变占AGS病例的50%以上。动物实验中，神经RNASEH2B失活的小鼠模型表现出小脑萎缩，白质缺陷和神经炎症的AGS典型病变。Top1cc在RNASEH2B缺失小鼠的小脑中的积累增加。证实，RNASEH2的缺失通过积累复制相关损伤（包括基因组核糖核苷酸，R-loops和Top1cc）而损害神经细胞的基因组完整性。

       《独立于I型干扰素信号传导的基因组不稳定性驱动核糖核苷酸切除修复受损引起的神经病理学(Genome Instability Independent of Type I Interferon Signaling Drives Neuropathology Caused by Impaired Ribonucleotide Excision Repair)》一文中Top1cc检测的酶免疫复合物检测（immune complex of enzyme, ICE)工作流程，用了将密度梯度离心与Dot-Blot分析的方法，主要步骤包括：

       1）脑组织裂解物加载到CsCl梯度溶液上面（最终自行成密度梯度为0.84-1.72g/mL），用NVT90转子42000rpm在25℃下离心20小时后，收集Top1cc的颗粒；

       2）Top1cc的颗粒经70%乙醇洗涤、干燥后，重悬于TE缓冲液，用25mM磷酸钠缓冲液（pH 6.5）稀释后，用Bio-Rad Dot-Blot转膜；

       3 先检测Blot中的蛋白复合物中，后在室温下用SYBR Gold染料对膜进行染色评估DNA的载量。

1.4 亚细胞组分分离

       NVT转头在亚细胞组份分离的应用涉及了肌膜、肝脏、中枢神经系统等特定组织的细胞器组分，如线粒体、过氧化物酶体、高尔基体及囊泡、内质网、溶酶体、自噬体（autophagosomes）、细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）/外泌体（exosomes）等。

       自噬(Autophagy)是许多细胞谱系和肿瘤细胞系中高度保守的过程，包括细菌、病毒和寄生虫在内许多病原体，可诱导受感染细胞的自噬。自噬缺陷与病毒感染的持续、肿瘤发生有关。抗原交叉呈递（Antigen cross-presentation）对于诱导针对肿瘤细胞和感染性病原体的适应性免疫至关重要。但对肿瘤细胞或病原体来源抗原的交叉呈递中自噬的调节相关机制了解不多。

       用Bortezomib（用作蛋白酶体活性的抑制剂和自噬的诱导剂）和NH4Cl（用于阻断溶酶体融合和自噬体降解）处理转染CFP-LC3和OVA抗原的HEK 293T细胞后，裂解细胞离心收集上清液，进一步以10000xg离心15 min获得含自噬体的粗大囊泡粗提沉淀（包含有线粒体、溶酶体和自噬体）和含胞质组分组成的上清液（含富含GFP-OVA抗原、胞质蛋白和微粒体等）。

       将含粗大囊泡部分沉淀重悬于percoll梯度溶液，用NVT65近垂直转头36000g离心30分钟后，收集各梯度层的组分（自噬体囊泡密度低于线粒体和溶酶体，可通过密度梯度离心将自噬体囊泡分离），从中回收自噬体囊泡。联合使用绵羊抗小鼠IgG、小鼠抗GFP抗体对GFP-LC3标记的自噬体进行层析处理，收集流过、洗涤和洗脱液的各层析组分后进行进一步抗原呈递分析和Western Blot检测。

       实验显示：抑制自噬几乎完全消除了交叉呈递，而诱导自噬显着增强肿瘤抗原的交叉呈递。NH4Cl阻断自噬体和溶酶体之间的融合，增强了交叉呈递。研究人员还成功将蛋白质抗原Ub-V-GFP-OVA在HEK293T细胞中的LC3阳性自噬体位点进行了定位。而使用黑色素瘤细胞的实验，也发现富含自噬体的测试组分介导了gp100抗原与幼稚pmel-1 T细胞的交叉呈递。

       该研究不仅确定了自噬体是抗原隔离、呈递给树突状细胞的抗原载体，而且交叉呈递OVA的能力与自噬体的量直接相关。提示自噬体在开发针对癌症和传染病治疗有效疫苗的巨大潜在价值。

       迄今为止，依托超速离心技术建立的最复杂实验分析方法恐怕非hyperLOPIT (hyperplexed LOPIT)和LOPIT-DC (LOPIT after Differential ultracentrifugation)技术莫属。

       LOPIT是localization of organelle proteins by isotope tagging (同位素标记蛋白细胞器定位分析技术)的简称，是一种既集成有蛋白多肽片段串联质谱标签(Tandem Mass Tag, TMT)技术、LC-MS/MS蛋白串联质谱分析技术（tandem mass spectrometry)或SPS (Synchronous Precursor Selection)-based MS3 technology使用串联质谱（MS / MS）或基于同步母离子选择的SPS-MS3技术（synchronous precursor selection MS3 ）和Bayesian temporal clustering analysis（Bayesian时间聚类分析）蛋白细胞器定位分析算法，又融合亚细胞组分超速离心分离的技术，用于表征和量化蛋白质亚细胞定位（每轮运行最多分析16种）的新型空间蛋白质组学方法（spatial proteomics）,可将数千种蛋白质原生态地精确定位到不同的亚细胞器（subcellular structures Or organelles），分析胞内区室（intracellular compartments Or cellular compartments）间蛋白质定位、定位功能失调（Dysfunctional protein localization）、蛋白在亚细胞间动态穿梭事件的中断（disruption of dynamic shuttling events），借此分析蛋白在细胞的生理功能或病理进程中所扮演的角色。

       LOPIT由剑桥大学生物化学系剑桥蛋白质组学中心的K. S. Lilley等人2004年发布，后又在此基础上于2016版推出迭代HyperLOPIT（细胞裂解流程、MS数据采集和蛋白质定位分类算法有进一步改进）、2019年的LOPIT-DC版。HyperLOPIT与LOPIT-DC两套实验流程的总体步骤、内容基本一致，区别在于第一阶段细胞裂解之后细胞器、膜蛋白离心分离纯化的方法路线。

       HyperLOPIT分析流程中，小鼠胚胎干细胞 ES-E14TG2a总蛋白的分离包括2项内容。

       1）一份培养细胞用去垢剂裂解，经洗涤去除胞质蛋白和膜蛋白，完成细胞核的富集和核蛋白质提取；

       2）另一份细胞裂解，去除细胞碎片后，采用碘克沙醇的不连续密度梯度100000xg在4℃离心60分钟，分别收集含可溶性胞质蛋白的上清、两个密度梯度溶液界面处的粗膜。

       粗膜组分用裂解缓冲液稀释后，先经200000g下4℃离心40分钟沉淀，再将膜沉淀重悬，用连续密度梯度100000g在4℃离心8 小时，分别收集各浮力密度（buoyant density）带的膜蛋白组分共20×0.5mL份。

       再将收集的20份膜蛋白组分经180000g离心20分钟后，收集沉淀。

       上述蛋白提取流程中，仅超速离心步骤就消耗了10个小时。

       LOPIT-DC是把hyperLOPIT方案中细胞裂解、MS数据采集和蛋白质定位分类算法优势与亚细胞组分差速离心方法相结合而开发的流程。在去除细胞匀浆液中残留细胞后，依各种膜组分沉降速度不同，用差速离心、速度梯次逐级增加的方法，分别收集膜蛋白、可溶性蛋白组分的沉淀分析。相较于hyperLOPIT工作流程的耗时冗长、人力技术资源和样品材料大量耗费，LOPIT-DC的蛋白分离操作简单经济，制备时间缩短近三倍，并实现和接近hyperLOPIT水平的分辨率和蛋白质亚细胞定位结果。

       hyperLOPIT流程中单独染色质和核蛋白制备步骤的引入，有利于分离染色质相关蛋白和其他核蛋白，为核蛋白定位提供更好的解析分辨率。而LOPIT-DC流程对线粒体和过氧化物酶体的高效分离，对于研究线粒体、过氧化物酶体、细胞质或蛋白酶体更便利。

       从LOPIT、HyperLOPIT再到LOPIT-DC，都无须纯化细胞器来抽提蛋白成份。相反，收集到的多管蛋白在经TMT技术标记后，还会混合同时进行质谱分析。而膜蛋白的交叉污染在质谱后数据分析过程中，通过细胞器蛋白定位多变量聚类分析中予以鉴别。这样既可以判定具有多个亚细胞结构区室间分布定位特点的蛋白质，又可实现特定蛋白在特定胞内区室分布丰度的量化及不同干预刺激、病理生理过程中的动态变化。

       LOPIT及后续改进技术方法，已在包括拟南芥根部和根来源的愈伤组织，黑腹果蝇胚胎，酿酒酵母细胞，HEK293人肾细胞系，DT40鸡淋巴细胞系， E14TG2a小鼠胚胎干细胞，人肺成纤维细胞巨细胞感染和大鼠肝脏细胞器等多个蛋白亚细胞器定位研究项目成功应用。

1.5 Beckman NVT转头实验应用情况小结
        截止至2023年6月30日的PubMed期刊文献数据，Beckman 超速离心机转头在实验报道中出现的频率，从高到底排名秩序依次是：SW 系列水平转头、Type Ti系列定角转头、NVT系列近垂直转头和VTi 系列垂直转头。其中，仅SW 41Ti这款水平转头（6×13.2mL/41000rpm）的报道文献记录就多达5943条。而使用Type系列角转头、NVT系列近垂直转头或VTi系列垂直转头中任一款转头的文献记录数量总和不过800次。NVT 65型近垂直转头的刊文数量相当于报道使用了VTi 全系列垂直转头的刊文量之和。

        资料显示：最早对Beckman近垂直转头用于实验样品分离公开报道的是美国马萨诸塞州波士顿布莱根妇女医院医学部的研究小组。他们在1994年用KBr将人体血浆调节至1.21g/ml的密度后，在NVT90近垂直转头中以80000rpm、不连续密度梯度超速离心45分钟，从新鲜血浆制备低密度脂蛋白(LDL) 。调研收集的NVT应用文献中，55%实验成果发表于2012-2023年间。考虑到定角转头、水平转头是最早成功投入商品化服务转头类型，再结合单一型号转头文献报道量，可以看出，NVT转头使用增长的势头明显，证明了NVT转头的巨大应用潜力。
        近垂直转头因为有一定倾角，被分离样品可沿管壁向外、向下滑向管底而产生沉淀。这给人的直觉是转头主要特长是用于蛋白和细胞组分沉淀分离。调研所收集的文献中，确有多篇与此应用有关。
        如用NVT90转子4℃下80000rpm离心1小时收集PBS缓冲液中类鼻疽菌Burkholderia pseudomallei外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)的沉淀以纯化菌体包膜用作免疫动物的抗原。对于人体皮肤真菌群的共生真菌M. sympodialis释放细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）MalaEx，用到NVT90转子100000g离心沉淀的办法制备感染单核细胞及人原代角质形成细胞的感染源。将转染携带跨膜蛋白Megf10基因逆转录病毒载体的10T1 / 2成纤维细胞裂解后，用NVT100转子4℃下65000rpm离心1小时，将细胞质，质膜，核膜和核区室的蛋白质分级沉淀分离，可从中验证Megf10在细胞质膜中的分布定位。研究研究人员为探究鞭毛内转运复合物A（intraflagellar transport complex A, IFT-A）的整体结构及组装机制，将原生动物四膜虫（Tetrahymena）全细胞提取物经离子交换色谱层析后，再用NVT65.2转子100000×g在4℃下离心1.25小时沉淀胞膜以纯化IFT-A用于后续其组成结构的分析。
        需指出，就目前掌握的资料看，近垂直转头的沉淀功能实际使用并不普遍。相反，大部分实验报道中，是用于单一蛋白组分或蛋白复合体、基因组DNA/质粒/RNA、rAAV病毒载体、细胞的细胞器和外泌体和膜脂肪酸等各类生物样品的连续或不连续密度梯度的分离。NVT用于区带速度离心和生物组分自形成梯度等密度离心，这一点毋庸置疑。

（待续：试析近垂直转子在超速离心中的应用-下）