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雷霆收罢江海凝 —— 试析近垂直转子在超速离心中的应用-下
（续：试析近垂直转子在超速离心中的应用-中）
2、超速离心实验中NVT转头的应用价值
全球有Beckman、日立Himac（已并入德国eppendorf）和赛默飞Sorvall三大超离制造商。受限于技术小组人力和时间，我们仅选择了Beckman落地式超速离心机的近垂直转头作为考察目标。
基于调研结果，我们来讨论本文开头提出的问题：NVT转头的性能优势、开发与使用NVT的特殊意义。
2.1 NVT转头应用的独特技术优势
超速离心时，溶液中的生物组分粒和蔗糖、CsCl等梯度介质分子在相当于105～106倍重力加速度强度的离心场中克服阻力水平离心方向迁移（沉降）。一定时间后，自动形成内侧低、外侧高的介质浓度分化（溶液密度）分布格局。各种被分离组分则依自身沉降速度或密度不同，在介质相应浓度区带中聚集，形成多条相互间隔一定距离、可视化的絮状条带。
上图形象地描绘了样品、梯度介质溶液层在超速离心过程中液体层从变形、分层再重新定位的演变过程。这足以说明，密度梯度离心分离过程，主要是由超强的离心场和相对微弱的重力场这两种机制共同作用下促成的。而维持梯度介质溶液的密度由内向外逐渐走高分布的是离心场。
不同密度带在管底处产生的液体压强不同：靠外侧密度相对较高的液柱压强大。当离心力减弱到一定程度后，在重力场作用下，最外侧液体密度带，向内推挤靠内侧较低密度的液层使之向内、横向偏移而偏离竖直状态。靠外侧高密度条带则顺势进驻密度较低条带原先占据的空间并持续扩张。不同密度条带因底部发生向心性摆动，使得在超速运行时呈现规整竖直状态的各密度液体层因此而出现倾斜变形、条带高度的降低。最终在持续的离心力衰减和重力双重作用下，各密度层内液体由竖改平、管内液体密度呈现上层低、底部高、垂直排列的稳定格局。相应地，被裹挟在各密度层内的样品条带，体位也随之出现了90°旋转。
在不发生剧烈振荡造成液层重混失误情况下（为避免离心结束转头刹车过程中发生已分离样品条带重混的风险，可采用优化Optima XE-90、Optima XPN-90超速离心机的减速速率设置，使转头尽可能平缓地减速），完成旋转并重新定位的液体，因底面积变小，各密度液层厚度都将增加，分布于各密度层内的被分离目标条带自身条带厚度增加的同时，相邻条带的间距也随之增大。离心管长度越长，条带间距的拉伸效果越显著。。
转头在设定转速下运行时，两组相邻条带的间距为d1，转头刹车后二者间距为d2，设定NVT转头管-轴夹角θ，则d2 = d1/cosθ。显然，d2 ＞ d1。当将样品管取出静置时，随着液层底面积缩窄，液层厚度更厚，相邻条带间距会在d2基础上进一步加大，故d3 ＞ d2。
NVT转头与垂直管转头、定角转头相同之处在于样品沉降距离短，有效分离所需时间短。NVT转头有一定倾角，样品中组成成份接近或沉降系数（sedimentation coefficient）相近的条带在分离结束、离心管取出后，条带相互间距加大，利于逐个条带收集操作，减少操作失误和污染。这一点比使用垂直转头时更便利。而相对于倾斜角度高达20°-45°的定角转头， NVT转头的沉降距离更短，分离所需时间缩短、效率提高。
从这一角度看，NVT转头沉降距离适中、分离后的条带间距大，既保证离心效率，又兼顾对样品中密度相近组分的分离质量，实现了效率和分辨率的统一。
2.2 NVT转头应用的独特效率优势
上个世纪80年代开始，分子生物学实验技术迅猛发展，对核酸纯化需求极其强劲。在NVT转头投产前，菌体质粒DNA或基因组的分离纯化常用甩平转头进行。CsCl初始密度1.71g/cm3在20℃条件下33000rpm离心，可获得高纯度DNA，但每轮离心耗时超过70个小时，效率极低。
超速离心机制造商推出NVT转头的初衷，正是用于取代常用的水平转头以实现快速CsCl梯度离心纯化质粒/DNA等样品。若改用NVT转头，加入EB和Triton x-100后使CsCl梯度溶液上样密度降低至1.55g/cm3，用78000rpm、20℃条件下完成相同样品离心，任务时间可缩短至4小时。
为何高转速的NVT转头离心可以节省离心时间？
超速离心达到一定时间后，密度梯度介质形成近轴端浓度低而远端浓度高的溶液浓度梯度（密度梯度）布局，即“自成梯度”现象。如上样时初始密度1.55g/cm3的CsCl溶液，最终形成了从近-远方向0.84–1.72g/cm3的新密度分布态势。
一般来说，相同温度条件下，梯度介质密度增加，不仅是溶液对样品颗粒的浮力阻力增加，溶液的粘度也会随之升高，故样品组分迁移时所受的摩擦阻力也增加。当样品所受正向离心力与介质溶液施加的反向阻力达到平衡后，原本缓慢沉降的样品迅速减速并最终停滞在特定位置、特定密度介质层中。收集处于不同位置的样品条带，通过折射仪检测后，即可获得该组分在特定实验离心条件下的浮力密度值。
可见，样品的浮力密度值与特定实验所用的转头性能属性、温度条件、工作转速、梯度介质类型与浓度均有关系。同种样品组分，实验条件不同，则测得的浮力密度数据，只可能比较接近，但难以完全一致。而正式超速离心实验刊文，一般无须提供样品的浮力密度数据。实际工作中，人们可参考前人提供的待分离样品组分浮力密度测试值，设计和优化实验所需的梯度介质类型、介质溶液初始上样浓度，选择介质的不连续阶梯密度或连续密度梯度的分离方案。
样品组分的浮力密度值与样品的沉降系数、在特定和梯度介质溶液中的迁移距离、有效分离所需时间的长短有直接关系。
上文列举的质粒DNA CsCl梯度离心，属自形成连续密度梯度离心（continuous density gradient centrifugation）或平衡等密度离心。自形成梯度密度离心时间的计算公式为：
公式中： N为离心实际工作转速（rpm）； ρP 为离心后样品条带所处位置离心介质的密度（代表该样品组分的浮力密度）；ｒp 为样品条带所处位置的离心半径值（从旋转轴心沉降到等密度带的距离）；β0为梯度介质的密度梯度比例常数；S20.W代表样品组分在20℃纯水中的沉降系数。
该公式表明：
1）采用同一转头离心时，提高工作转速，将节省离心时间。
随着转速提高，梯度介质生成的密度-离心半径构建的曲线斜率增加。越接近离心管底部（外侧），密度曲线的斜率越大。而密度梯度曲线变陡，则不仅使单一组分聚集形成的条带缩窄，而且不同浮力密度组分所生成的各条带之间分布更密集。
而基于前面NVT转头技术优势的讨论意见， 当相邻组分条带的间距相近时，NVT转头要比甩平转头离心后的条带收集操作更便利。
2）转速相同，不同转头离心半径不一，其梯度介质密度梯度曲线大相径庭，造成同种样品组分条带的分布位置存在差异。
如图所示，甩平转头的ｒp显然大于角转头和NVT转头。从NVT 90转头和SW60 Ti两款转头60000rpm转速、20℃温度、相同初始浓度CsCl溶液离心相同时间后所形成的自成梯度曲线图中可以看出，ρP=1.60g/mL梯度条带对应的ｒp，NVT 90转头中为57.1mm，而SW60 Ti转头为112.7mm，其差异之悬殊显而易见。
3）相同样品组分、温度、初始梯度介质溶液和转速情况下，样品组分实际ρP值有出入，但十分接近。故两种离心环境下ρP-1值接近。但ｒp则不同：样品条带所处位置ｒp中，甩平转头的ｒp比NVT转头的ｒp值大得多。
根据公式计算结果是：样品在NVT转头完成分离所需离心时间将明显少于甩平转头的用时；若在NVT转头上采用更高转速，则离心时间还有进一步压缩的空间。
2.3 转头离心效率的简单评估方法
先看一下Beckman 超速离心机NVT、SW转头工作性能比较表。
转头的k-Factor（k因子）可简单地概括为：
1）K数值越小，则转头分离效率越高；
2）它对应于转头的Rmax/Rmin比值、转头最高工作转速；
3）运行转速降低和最大有效离心半径减小，K因子数值会升高。表2列出了各转头在不同转速条件下K数值的变化。
对使用者而言，K因子的价值在于可用于衡量转头离心效能和离心时间的简单评估。
在样品、离心介质溶液和温度都一致情况下，有效离心时间与K因子成正比，与样品组分沉降系数成反比。
用公式可表示为：
T=K/S
基于沉降系数与样品浮力密度密切相关，采用不同转头时测定的沉降系数略有出入。因此，公式可以用于样品有效离心时间长短的简单粗略评估时参考。这一点，无论Beckman Microfuge 16台式微量高速离心机、Allegra X-30R台式冷冻离心机、Avanti JXN-26 和Avanti J-26S XP立式大容量低温高速离心机，还是Optima XE-90、Optima XPN-80和Optima XPN-100超速离心机都适用。
表2. Beckman 超速离心机NVT、SW转头工作性能比较表
Rotor Capacity | Speed | RCF max RCF av RCF min | R max R av R min | k-factor | Rotor Capacity | Speed
| RCF max RCF av RCF min | R max R av R min | k-factor |
SW 60 Ti (6×4 mL) | 60000 rpm | 484289 ×g | 120.3 mm | 45.0 | NVT 100 (8×5.1 mL) | 100000 rpm 80371 rpm 75680 rpm | 749223 ×g 484289 ×g 369155 ×g | 67.0m m 57.6 mm 48.3 mm | 8.0 |
12.4 | |||||||||
369155 ×g | 91.7 mm | 14.0 | |||||||
NVT 90 (8×5.1 mL) | 90000 rpm 78019 rpm 73063 rpm | 645000 ×g 484289 ×g 369155 ×g | 71.1 mm 61.8 mm 52.4 mm | 10.0 | |||||
254020 ×g | 63.1 mm | 13.3 | |||||||
15.2 | |||||||||
SW 55 Ti (6×5 mL) | 55000 rpm | 367022 ×g | 108.5 mm | 48.0 | NVT 100 (8×5.1 mL) | 100000 rpm 66633 rpm 69967 rpm | 749223 ×g 286175 ×g 367022 ×g | 67.0 mm 57.6 mm 48.3 mm | 8.0 |
18.0 | |||||||||
16.3 | |||||||||
286175× g | 84.6 mm | NVT 90 (8×5.1 mL) | 90000 rpm 64329 rpm 67920 rpm | 645000 ×g 286175 ×g 367022 ×g | 71.1 mm 61.8 mm 52.4 mm | 10.0 | |||
19.6 | |||||||||
17.6 | |||||||||
205667 ×g | 60.8 mm | NVT 65.2 (16×5.1 mL) | 65000 rpm 57114r pm 60185 rpm | 416000 ×g 286175 ×g 367022 ×g | 87.9 mm 78.4 mm 68.8 mm | 15.0 | |||
19.4 | |||||||||
17.5 | |||||||||
SW 41 Ti (6×13.2 mL) | 41000 rpm | 287792 ×g 207150 ×g 126696 ×g | 153.1 mm 110.2 mm 67.4 mm | 124.0 | NVT 65 (8×13.5 mL) | 65000 rpm | 402000 ×g | 84.9 mm | 21.0 |
55039 rpm | 287792 ×g | 72.2 mm | 29.3 | ||||||
50636 rpm | 207150 ×g | 59.5 mm | 34.6 | ||||||
SW 40 Ti (6×14 mL) | 40000 rpm | 284123 ×g 201642 ×g 119339 ×g | 158.8 mm 112.7 mm 66.7 mm | 137.0 | NVT 65 (8×13.5 mL) | 65000 rpm | 402000 ×g | 84.9 mm | 21.0 |
54687 rpm | 284123 ×g | 72.2 mm | 29.7 | ||||||
49958 rpm | 201642 ×g | 59.5 mm | 35.5 | ||||||
采用5mL样品管，梯度介质和离心温度均相同时，SW 55 Ti在最高转速55000 rpm工作时，分离时间将是此转速下NVT 65.2离心用时的2倍以上。而若采用NVT 65.2最大工作转速运行，则离心时间进一步降低至SW 55 Ti转头用时的1/3。
超速离心机制造商开发NVT转头，真可谓用心良苦哈！
2.4 应把握好NVT转头带来的机遇
超速离心实验耗时冗长，少则数十分钟，多则持续十几小时甚至24小时以上。单台机器可接待实验人次均明显少于普通台式低温离心机。超离实验多的单位，超速离心机资源往往十分紧张。而新购超速离心机、添置转头升级的花费不菲，众所周知。
科研的研究对象繁杂，所用转头类型和工作条件难以统一。而超速离心转头有4种功能类型，每一种类型的转头按转速、单管容量（4ml - 38.5mL）分为多个型号。超速离心机管理部门要将如许多种转头配齐，所需预算之浩大将超乎想象。而做到用尽可能少的转头配置满足尽可能多的应用需求，需要管理服务部门转变观念，充分了解每种转头的功能特性。这有利于发挥资源配置优势，提高设备服务效益。
中小企业超速离心应用流程对转头性能的需求相对固定。通过提高超速离心机运行效能，避免单纯依靠增加设备数量的单一途径来扩大产能，是减轻设备投资成本压力的有效解决方案。
资料表明，NVT类型的转头在超速离心机转头中资历虽浅，但功能及应用范围，与使用频次最高的水平转头并无二致。通过优化运行参数条件，用NVT转头承担一部分水平转头的离心工作，从理论到技术上都具有可行性。
然而，实际工作中所用超速离心程序设置，或基于既有工作规范，或参考同类实验文献提供的实验条件数制定。要充分发挥NVT转头多面手优势，首先要面临的难题是：如何基于现有水平转头上的工作参数，制定样品转移到NVT转头高效离心的所需参数设置。
我们认为，无论采用何种转头工作，运行参数的设定须满足两个基本条件，首先是密度范围有效，其次是离心力指标有效。
密度范围有效，是指在设定转头设定工作条件下，要确保样品中各目标组份在分离后都包含在梯度介质溶液所形成的密度范围内，理想的密度梯度曲线还应使分离组分聚集的条带尽可能窄。
离心力指标匹配，是指新的工作转速对应的最大与最小离心力要优于或与原工作离心力等效，满足样品组分离心所需最低离心力条件。
下面以SW41水平转头和NVT65近垂直转头的密度梯度曲线对比图为例予以说明。
采用相同初始浓度的CsCl梯度介质溶液上样、离心温度统一设定为20℃。当SW41转速为30000rpm时，介质自形成密度的范围为1.19 ～ 1.87g/mL。当转速设定为35000rpm时，介质密度范围为1.06 ～ 1.86 g/mL。若将样品转移至NVT65上离心，只有转速65000rpm对应的介质梯度范围1.26 ～ 1.86 g/mL与SW41对应的30000rpm工作条下梯度密度生成范围最匹配，可以同时兼顾所有条带的浮力密度范围。
经过简单计算，30000rpm时SW41转头离心力范围为67832 ～ 110934×g；转速35000rpm时离心力范围是92330 ～ 150993×g。而NVT转头在设定转速条件下，离心范围为281113 ～ 341040×g，均高于原离心力指标，确保离心力可以使被分离组分有效离心。
上述两个条件均不理想时，应以密度梯度范围的匹配作为优先原则调整NVT转头转速的设定。就此处案例而言，用NVT65转速65000rpm取代SW41转头30000-35000rpm转速离心，是切实可行的。
从表2可知， NVT65转头采用65000rpm工作转速取代SW41转头30000rpm离心相同样品时，在两种情况下浮力密度接近的情况下，根据K因子与沉降系数离心时间评估方法，NVT65有效离心时间约为SW41转头的10%，可见优化离心工艺对离心效率提升的巨大价值。
因此，在制定超速离心机转头配置方案时，在单管样品容积同等条件下，角转头、垂直转头和NVT转头及水平转头四者中，可将NVT转头作为优先选项。
如NVT 65（8×13.5mL; 65000rpm）近垂直转头、Type 70.1 Ti（12×13.5mL; 70000rpm）角转头、VTi 65.1（8×13.5mL;65000rpm）垂直转头与水平转头SW 41 Ti（6×13.2mL; 41000rpm）SW 40 Ti （6×14mL; 40000rpm）之间，可首选NVT 65。
在水平转头SW 32 Ti（6×38.5mL; 32000rpm;k Factor=204）、SW 28（6×38.5mL; 28000rpm;k Factor=246）之间，按K因子值从低到高排序，可首选SW 32 Ti。
为尽可能照顾实验人员操作习惯、简化管理服务工作，SW 32 Ti（6×38.5mL; 32000rpm）水平转头、VTi 50.1（12×39mL; 50000rpm）垂直转头和两款角转头Type 50.2 Ti（12×39mL; 50000rpm）、Type 70 Ti（8×39mL; 70000rpm）中，SW 32 Ti优先，可能会让实验者更觉暖心一点。
在确保操作规范安全前提下，用优化超速离心运行参数设置的方法，可充分发挥NVT转头高效便利优势，迅速提升设备产能，大幅减轻设备操作和管理负担，具有巨大经济社会效益，也是超速离心机管理者和使用者从我做起、践行低碳节能工作理念的集中体现。
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