雷霆收罢江海凝 —— 试析近垂直转子在超速离心中的应用-上

       Beckman二战后到上世纪80年代，大批有影响力的超速离心技术理论专著出版发行。如1959 年，生物化学家 Howard K. Schachman教科书式著述《生物化学中的超速离心》出版。1962 年，Hiroshi Fujita用《沉降分析数学理论》系统阐述了超速离心实验中扩散综合效应、溶质沉降系数浓度依赖性和沉降边界形状的数学理论，随后1975 年他的《超速离心分析基础》一书问世。此外， Steensgaard. J 等的《生物化学的方法学发展》，C.A. Price 的《密度梯度离心》和B.D. Hames的《密度梯度离心条件的选择》等著述涌现，可视为超离技术理论体系构建完成并日臻完善的标志。

        同时，超速离心方法的开发应用也取得了长足进步。1951年Myro Kendall Brake提出了速度-区带密度离心方法（rate-zonal centrifugation）。1959年，Matthew Meselson和Christian de Duve等成功开发等密度梯度离心法（Isopyonic centrifugation）。Matthew Meselson还与 Franklin Stahl使用高浓度CsCl溶液超速离心实验中成功分离DNA样品。超速离心理论的引领和新方法的应用，推动生命科学研究领域里程碑式重大发现的井喷。借助超速离心技术，业界陆续发现了线粒体和核糖体（蔗糖密度梯度离心法）和溶酶体等细胞器，建立了噬菌体遗传物质是DNA、 DNA半保留复制和DNA复制中的冈崎片段等关键基础理论。
       当超速离心机的定角转头和水平转头已成功应用近半个世纪后，近垂直转头（Near-Vertical Rotor, NVT)终于在1989年姗姗来迟。比起甩平转头已沉淀的海量应用底蕴，错失科学大发现风口的NVT转头，是实实在在的“输在起跑线上”。
       超离用的NVT转头有何独特性能优势，Beckman等超离巨头推出NVT初衷是什么，而NVT对使用者而言到底有何特殊价值？这些问题正是本文尝试探讨的主题。
       NVT近垂直转头是充分融合定角转头（20°- 45°）和垂直转头（Vertical Rotor, VT）两二者属性特点而开发的一种较新型转头。从剖面上看，转头的离心孔、转轴的中线间有一7.5°– 8.5°的夹角，本质上它属于定角转头。但其角度明显小于定角转头的20° - 45°角，而与垂直转头的0°角极近，故命名为近垂直转头。                                              

      NVT既有垂直转头样品容量大、可承受的梯度介质密度高（可达1.7g/ml）、转速高（Optima XE-100、Optima XPN-100系列超速离心机近垂直转头NVT100可承受100000rpm）、样品沉降路径短、分离速度快（离心时间比垂直转头稍长，但比定角转头、甩平转头都短）的优势，又因有固定倾角，被沉淀组分可沿离心管外侧管壁滑向管底部并沉积成团（pelleting）。特定组分通过沉淀与其它可溶性成份分离后，收集沉淀十分方便。而在质粒纯化肘，NVT转头可将RNA在梯度介质下层管底形成沉淀，避免RNA了与质粒DNA样品带接触，防止污染。
       理论上，NVT转头可用于膜蛋白质等生物大分子和细胞器的差速离心（Differential centrifugation）沉淀、速度-区带离心（Rate zonal centrifugation），还可承担平衡密度梯度离心（equilibrium density gradient centrifugation）或等密度离心（Isopycnic centrifugation）任务。
       阿拉斯加科技（北京）有限公司应用支持小组，在2023年6月份，组织实施了一项对Beckman超速离心机转头在科研实验中应用情况的分类调研计划。调研的结果从本篇开始陆续刊载。

1、Beckman NVT转头在生物样品超速离心的实际使用概况

       调研对象：Beckman NVT 100、NVT 90、NVT 65和NVT 65.2四个近垂直转头

       调研内容：NVT离心分离的具体对象和使用方法

       资料来源：截止至2023.06.30 PubMed期刊在线数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）已收录的、使用了上述四个转头中任何一个进行样品超速离心处理的公开实验论文。

表1.  Beckman NVT系列转头文献使用频次统计

       表1显示，Beckman超速离心机配套的4个近垂直转头中，论文中出现次数最多的是NVT 65和NVT 90。

       根据SCI期刊影响因子查询网站（http://sci.justscience.cn）各期刊2023年的IFoid分值数据，先剔除无IFoid分值或分值≤4.000的刊文；再将文中转头信息明显有误的记录舍弃，最后把属于同一研究小组发表在不同年份不同、但超离部分实验采用完全相同离心参数条件的多篇论文视作1篇统计处理后，剩余79篇刊文。

       逐篇文章梳理复核后，按离心实验样品的类型逐一归类统计，结果见下图1。

       统计结果显示，近垂直转头适用的对象涵盖了蛋白、核酸、病毒、细胞器和脂肪酸等五大类生物组分。NVT的应用案例有限，却亮点纷呈。

1.1 病毒类样品分离

       Beckman NVT系列超速离心机转头用于病毒类样品分离纯化主要是三个用途。一是从转染了重组腺相关病毒载体（recombinant adeno-associated virus vectors, rAAV vectors)的细胞中分离载体病毒，评估验证病毒表达和滴度。二是将外源靶基因整合于病毒载体经细胞表达后制备收集疫苗类蛋白。三是构建病毒特定编码基因的突变体，分离转染细胞的表达产物，以了解病毒结构蛋白或特定功能蛋白复合体的组装机制。

       资料显示，与NVT转头有关的病毒类应用中，报道最多的(rAAV vector，其次是噬菌体(phage)和病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)。

       CRISPR/Cas9是目前基因组编辑操作最流行的工具。而腺病毒相关载体以其体内低免疫原性、非致病性、稳定长效表达和一定程度的组织选择性，被视为最有前景的基因转导载体。由此吸引了人们将CRISPR-Cas9与AAVs一起部署开发新型AAV-CRISPR-Cas9载体平台，以期安全有效地用于基因组编辑、转录调控和拓展改进rAAV的应用。哈佛大学研究人员对修饰小鼠遗传缺陷的治疗工具载体AAV-Cas9-gRNA的病毒生物分布、各种器官的编辑效率、抗原性、免疫反应和生理反应等进行了评估。结果表明，AAV-Cas9-gRNA在小鼠体内可有效激活宿主免疫，未出现其它载体工具中常见的细胞损伤现象。对rAAV载体的纯化，使用了Optiprep（主要成分是碘克沙醇odixanol）密度梯度介质的离心方法。将含AAV的细胞裂解上清液，经50 kDa MWCO超滤和浓缩处理，加载到由15%，25%，40%，60%各2ml组成的不连续密度梯度液顶部。使用NVT65转子58000rpm、18℃离心1.5小时后，收集位于40% - 60%梯度界面处的AAV条带进行下一步分析测定。

       噬菌体（Bacteriophage）是一种专门感染细菌、真菌、放线菌、螺旋体等微生物的病毒，分为毒性噬菌体（virulent phage）和温和噬菌体（temperate phage）两类。

       毒性噬菌体感染宿主后，会利用细菌胞体内的原料合成核酸和蛋白质装配成成熟的子代噬菌体，并最终裂解宿主菌体，释放出子代噬菌体继续下一步感染。温合噬菌体感染细菌，只将自身基因整合到细菌染色体上（自身其余结构组件溶解），但不引起细菌裂解。这种整合在细菌基因组上的外来噬菌体基因称为原噬菌体/前噬菌体（prophage）。原噬菌体可随细菌染色体的复制而复制，并通过细菌的分裂将原噬菌体传给下一代细菌。当有低剂量紫外线照射，或其他物理、化学方法等诱导因素作用时，前噬菌体可被激活，自我复制并产生大量新的成熟噬菌体，裂解宿主胞体并释放出噬菌体粒子。温和噬菌体这种产生成熟噬菌体和溶解宿主菌的潜力，称为溶原性( lysogeny)。

       在漫长的进化机制驱动下，细菌与噬菌体间演变为一定程度的相生相克、互利互惠关系。一方面细菌通过CRISPR-Cas系统机制对抗毒性噬菌体感染。另一方面，细菌明修栈道暗度陈仓，在受辅助噬菌体（属温活噬菌体）感染后，细菌蛋白编码基因激活，与噬菌体的支架蛋白（scaffolding protein, SP) 竞争衣壳蛋白 (capsid protein, CP) 结合位点而改装噬菌体衣壳蛋白内部空间构象。改装后的噬菌体衣壳蛋白，无法容纳噬菌体整个基因组，只能进行细菌特定基因片段的包装。借此狸猫换太子的神操作，宿主菌利用辅助噬菌体的病毒组装机制产生大量具有感染活性的假噬菌体颗粒。最终，随着宿主菌体裂解，携带有宿主菌基因的假噬菌体释放并感染新宿主菌，细菌特定基因得以在菌体群落中保留与潜行。

       金黄色葡萄球菌的大多数毒力因子编码在前噬菌体、质粒和基因组岛等可移动基因元件（mobilegenetic elements，MGEs）上。金黄色葡萄球菌致病岛(Staphylococcus aureus pathogenic island，SaPI)是一个编码包括毒素、粘附素、凝血因子和免疫调节因子等一系列毒力因子的庞大基因组岛家族，属典型的噬菌体诱导性染色体岛(Phage-Inducible Chromosomal Islands，PICIs)。在无辅助噬菌体感染时，SaPI表达被抑制子抑制而处于前噬菌体状态。在辅助噬菌体感染并处于溶菌周期时，噬菌体表达一种去阻遏蛋白帮助SaPI从宿主染色体上切除、复制并表达。其表达产物可通过调节辅助噬菌体衣壳的装配，使SaPI基因被优先包装防止形成成熟的噬菌体颗粒。噬菌体转导的MGEs水平转移( horizontal gene transfer)导致新的毒素基因产生、不同菌株基因组间的差异以及高致病性菌株的产生，在细菌基因组进化和适应环境压力中发挥重要作用，引起了学界广泛关注。

       温合噬菌体80α是感染金黄色葡萄球菌和其他革兰氏阳性细菌的辅助噬菌体的代表，是包括SaPI1，SaPI2和SaPIbov1在内多种SaPI移动遗传元件高频动员的辅助者。80α具有直径为63 nm的T = 7二十面体衣壳和190 nm长的弯曲尾部。80α衣壳蛋白（CP，324个残基）首先组装成一个空的前衣壳（procapsid），需支架蛋白（SP，206个残基）作为组装伴侣。SaPI1通过编码的CpmB蛋白，与80α衣壳蛋白结合，将噬菌体80α衣壳打造成了SaPI1基因组的私人定制包装。

       美国国立卫生研究院国家关节炎-肌肉骨骼和皮肤病研究所的研究小组采用了2-3步超速离心的方法分离纯化2株金黄色葡萄球菌的蛋白组分，用于Western Blot检测和前衣壳蛋白的电子显微镜结构分析。实验中蛋白样品制备流程简述如下：

       1）用丝裂霉素诱导金黄色葡萄球菌80α溶原菌株诱导表达产生噬菌体80α前衣壳procapsids；

       2）裂解菌体后，7000g离心20 min去除菌体碎片；

       3）上清中可溶性蛋白，用10% PEG 8000（w / v）和0.5M NaCl重悬后，7000g离心20分钟，收集沉淀；

       4）将沉淀重悬于噬菌体缓冲液中，上样覆盖于浓度1.42 g/cm3的CsCl溶液层上，用Beckman NVT90转子15℃ 70000rpm离心20小时。 用针头收集含有前衣壳的条带，用噬菌体透析缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.8，50 mM NaCl，1 mM MgSO4和4 mM CaCl 2）透析处理除去样品中的CsCl；

       5）初步纯化的噬菌体蛋白组分在10–40%（w / v）蔗糖连续梯度液中用SW41转子4℃ 30000rpm离心2小时，将前衣壳与噬菌体尾巴分离。收集纯化后的前衣壳条，一部分用于SDS-PAGE实验鉴定，其余部分用于下一步的操作；

       6）经蔗糖梯度纯化后的样品用透析缓冲液稀释后，在70Ti转子中50000rpm 4℃下1小时离心后，将沉淀重悬于噬菌体透析缓冲液中。制备衣壳蛋白的电子显微镜分析样品。

       病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)具有与病毒颗粒类似的结构，但不含复制酶和编码病毒结构蛋白的核酸，缺乏复制能力。大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物等多种表达体系可表达VLPs。诺瓦克病毒（Norwalk virus, NV）是一种可造成人类急性胃肠炎流行性暴发的单链RNA病毒。其衣壳由主要结构蛋白的多个拷贝构成，决定着病毒结构完整性、免疫原性和感染性。衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达后可自组装产生在形态和抗原上与天然NV颗粒十分相似的NV病毒样颗粒。

       为鉴定参与组装NV衣壳蛋白功能结构域，研究人员构建了10个衣壳蛋白的缺失突变体用VLP作为载体转染昆虫细胞。将细胞裂解液添加至30%初始浓度的碘克沙醇溶液顶部，通过离心形成自生成等渗密度梯度，用NVT-65.2转子中63000rpm离心3小时后，收集蛋白条带，经进一步纯化后用于昆虫细胞表达的可溶性蛋白质的结构分析和Western Blot检测。

1.2 质粒/核酸纯化

       Beckman 超速离心机NVT系列转头用于核酸分离纯化应用的报道，除了常规组织/细胞/微生物DNA(如HSP90基因、线粒体DNA（mtDNA)、工程菌体质粒DNA纯化（如pUC：HSP90rr环状质粒）和RNA/Poly(A+) RNA分离外，还有环境微生物研究中关于DNA稳定同位素核酸探针检测(Stable isotope probing of DNA, 13C-DNA-SIP)、RNA稳定同位素探针检测 （Stable isotope probing of RNA, RNA -SIP）等应用。

（待续：试析近垂直转子在超速离心中的应用-中）