瞬息凉炎代谢频——动物能量代谢分析系统消除水蒸气稀释效应的技术途径(上)

       检测呼吸气体交换率(Respiratory exchange ratio, RER)或呼吸熵(respiratory quotient, RQ)过程中，对水蒸气的产生影响和应对策略，德国TSE、美国Sable和Columbus三大动物能量代谢监测系统制造商间是不同的。

       TSE PhenoMaster NG代谢与行为表型分析系统的CaloSys Module，是在采样气路中引入物理干燥装置-水蒸气冷凝阱(water condensation trap)去除气体中的水蒸气，再进行O₂和CO₂测定。

       Columbus CLAMS系统则采用化学洗涤器——气体干燥柱（Drierite Column）滤除水蒸气后，再输入Oxymax模块实施气体分析。

       Sable Promethion Core系统代谢气体检测模块的核心是气体分析仪和流量调节组合式控制单元（Combined Gas Analyzers and Flow Regulation, CGF）。测试气流经过滤颗粒后直接输入GA-3气体分析仪检测。没有用气体干燥处理来消除水蒸气，而是以水蒸气补偿（Water vapor compensation）算法修正检测误差。

        无论TSE的冷阱冷凝、Columbus的气体干燥柱，还是Sable的水蒸气补偿校正算法，都面临着大量水蒸气可能对能量代谢气体监测产生的不利影响，即水蒸气稀释效应问题。

一、什么是动物能量代谢气体检测中的水蒸气稀释效应？

       常规动物能量代谢呼吸气体监测实验，测试笼内部采用Pull（负压抽吸）模式控制气体的流动和呼吸交换气体测试的采样。采集的气体包括笼内采集的测试气样、一份从空测试笼或测试室内采集的等体积空气对照气样。输入笼内未经动物呼吸前的气流，其组成成份、体积与对照气样完全相同。将输入气流为观察目标，分析其中O₂、CO₂、H₂O和N₂（代表的其它不参与代谢气体交换空气组分）在经呼吸气体交换前（输入气流，incurrent flow）、交换后（输出气流，excurrent flow）含量的变化，既是测算出通过呼吸消耗的O₂和产生的CO₂体积量化关系的必由之路，也是加深对水蒸气稀释效应产生机制与影响理解的关键。
       代谢气体测试中的水蒸气来源复杂，既有机体能量代谢的产物（包括动物排出粪便蒸发的水汽）、测试室内空气中的水蒸气，还有饮水瓶口、动物舔舐饮水过程溢洒液滴蒸发的成份。

       水蒸气作为代谢气体监测指标看似毫无价值，但其实，它在代谢气体产物中的占比不容忽视。以糖、脂肪代谢反应为例：
       葡萄糖：C₆H₁₂O₆ + 6 O₂ → 6 CO₂ + 6 H₂O
       三油酸甘油酯：C₅₇H₁₀₄O₆ + 80 O₂ → 57 CO₂ + 52 H₂O
       在葡萄糖代谢反应中，产生的H₂O分子数与CO₂产量、O₂消耗量相等。CO₂增量与O₂消耗量相互抵消后，体系净增等量的水蒸气。脂肪代谢反应中同样表现为CO₂+H₂O的增量高于O₂减量，体系中气体总量的增加。
       根据符合阿伏伽德罗定律(Avogadro's Hypothesis)，同温同压条件下，测试气体中组分量的变化，相应气体体积必然发生等比例的收缩或扩展变化。
       为方便表述，规定：
       V_in代表测试采集的对照气流，即一定时间内测试笼内输入气流体积；
       V_ex代表输入气流经呼吸交换后的实际体积，是应当被系统完整采集用于分析的输出体积；
       F_in代表初始输入气流中各组成气体的气体分压(incurrent fractional of gas)；
       F_ex代表初始输入气流经呼吸气体交换作用其中各组成气体分压的变化，即输出气体分压（excurrent fractional of gas）；
       N₂代表不参与能量代谢反应过程的所有其它空气组份，即非代谢气体，在呼吸气体交换前后，其含量（气体量或气体mol数）、体积均保持恒定，用蓝色柱条表示。代谢气体组分中的O₂、CO₂、H₂O分别用绿色、红色、黄色柱条表示。

       呼吸气体交换前，输入气流中CO₂、H₂O含量极低。呼吸交换发生后，水蒸气、CO₂含量明显上升，其增量在抵消O₂的减量后仍有盈余。CO₂、O₂和水蒸气含量此消彼长的结果是体系中气体总量/总体积出现净增量。
       输入气流中的O₂总量减少，N₂总量不变，但二者的分布体积都增加了，故浓度均下降。CO₂含量、分布体积虽都增加了，但含量的增幅显然大，反而表现为浓度的轻微上升。
       当系统流量控制器从测试笼内依然按对照气体的流量即输入流量采集测试气样时，其体积因小于实际应采样体积即输出体积。无形中，造成了O₂、CO₂、H₂O和N₂的采样损失。因系统采样误差，使得各组分测试值都低于实际值，即出现了气体浓度稀释的假象。业内把这种现象视作水蒸气稀释效应（water vapor dilution）。
       而根据以上推导过程，测试值误差是输入气体体积膨胀后与系统默认的输入流量不匹配所致。而造成输出气流体积扩张的实际上并非仅水蒸气一个因素，CO₂在其中亦发挥了推波助澜的关键作用。因此，将气体含量值降低的稀释效应归结为水蒸气稀释效应，显然与实情相悖，是片面、不严谨的。
       采样流量系统误差造成测试值的压低，使测算的O₂消耗显著增加（VO₂被高估）、排放CO₂轻微减少（VCO₂被低估），最终必是RER（RER = VCO₂/VO₂）被严重低估（dramatic underestimation）。只有将初始输入气流、输出气流中CO₂、O₂各自的含量差值厘定清楚，才能完整、准确地测算出代谢气体RER。
       消除稀释效应的技术途径实际运用的有两种。一是对笼内测试采样气体流量进行校正以减少CO₂、O₂流失。二是先滤除水蒸气，再校正对照和测试气体流量，确保输入检测单元的对照与测试气体流量一致。

二、能量代谢气体测定中水蒸气稀释效应的解决方案

       为了破解动物能量代谢呼吸气体监测中的水蒸气稀释效应难题，TSE、Sable和Columbus各自所提供的解决方案都很有代表性。

2.1 Columbus CLAMS化学洗涤器除湿法

       以CLAMS系统Oxymax氧气监测模块气路结构为例，对照、测试气体由通用气体调节器（Universal Gas Conditioner）采集后，先输入气体干燥柱（Drierite Column）除去水蒸气，再返回调节器送往氧化锆高速传感器（Zirconia Oxygen Sensor）检测。
       通用气体调节器、氧气检测器、系统通用流量控制器（Universal Flow Controller）之间有信息反馈通路，控制着气体调节器的气体采集和输送操作。

       气体干燥柱内装填的是天然石膏（无水硫酸钙）与二氯化钴混合成份（desiccant or drying agent）。CoCL₂用作吸附水蒸气饱和程度的指示剂：柱有吸附活性时显示为蓝色，吸收水汽后渐变为蓝紫色，当柱使用寿命耗尽时变为粉红色，方便用户根据柱体颜色变化决定柱体更换时间。

       一根干燥柱的连续工作寿命超过 36小时。可以将两根柱串联起来使用，可延长续航时间，避免实验测试中断风险。Drierite柱均可多次再生、重复使用，操作维护简便。 

2.2 TSE PhenoMaster NG的水蒸气冷凝除湿法

       CaloSys Module的水蒸气净化核心模块包括取样切换控制单元（Sample Switch Unit）、气体干燥单元（Air Drying Unit）两部分（图中绿色虚线框所示）。取样控制单元抽取气体输送至气体干燥单元干燥处理。
        对比TSE PhenoMaster NG的CaloSys Module与Columbus CLAMS 系统Oxymax模块会发现，二者气路结构布局有区别：CLAMS 系统的通用气体调节器直接连通干燥装置和Oxymax模块气体检测。而TSE系统的干燥气体先进入校正处理控制单元（Calibration Process Control Unit），校正控制单元接收气体并输送给CaloSys主控单元（Calorimetry Master Process Control Unit），由后者接力传输至CO2/O2含量检测单元。很明显，单靠去除水蒸气还难以确保测试结果的准确性。而校正控制单元一个重要功能必是对除湿气体的流量校正。

       低温冷阱装置是在冷冻干燥机、低温离心浓缩议等仪器广泛采用的空气冷凝除湿手段。TSE的空气干燥单元采用珀耳帖致冷控制冷阱，工作温度设定为+5℃。室温样气输入后被快速冷却，所含水蒸气因低温过饱和而析出、凝聚，顺着冷阱内壁流入机器底部的冷凝水收集容器。容器有排水口和排水管可导出冷凝水，完成空气与水蒸气的分离。

       TSE提供两种规格的空气干燥器： 1x Air Drying Unit（单除湿通道）和4x Air Drying Unit（1-4除湿通道）。单通道除湿器与测试笼、对照笼的配置的数量一一对应。每套装置包含上下两级冷凝水收集器：底部收集容器和顶部分离瓶。

       4通道除湿器能连接4路气体同时除湿。4个气路并联，各自有独立管路和冷凝水收集容器。该型号可降低购置成本，并节省设备工作空间。特别适合8-16笼测试笼位系统，或需同时对多个笼位同步、连监测续的应用系统使用。 

2.3 Sable Promethion Core算法补偿技术

       Promethion Core系统的水蒸气补偿技术是由CGF控制单元、PromethionLive软件平台和控制计算机共同完成的。CGF集气体发生控制、气体流量调节和气体分析于一体。流量控制器模块采集等分气样，过滤尘埃颗粒物后输入气体分析仪的37℃恒温舱，进行O₂、CO₂和水蒸气的同步检测。CGF集成的多组高精度刀片式气体检测卡，可加快系统的数据分析进程，减少检测数据相对于采样的滞后效应（lag effects）。

       算法校正水蒸气补偿技术，可归纳为以下步骤:

       1）采集等体积的对照气体（即输入体积）、测试气体(为实际输出体积，非理论输出体积)，测定O₂、CO₂和水蒸气的气体分压。

       F_inCO₂、F_inO₂、F_inH₂O代表各输入气流中的各自气体分压；

       F_exCO₂、F_exO₂、F_exH₂O代表各输出气流中各自气体分压。

       2）输入、输出气流中的N₂气体分压，分别以F_inN₂、F_exN₂表示。

       根据道尔顿分压定律（Dalton’s of partial pressures），得到：

        F_inN₂ = 1 - F_inCO₂ - F_inO₂ - F_inH₂O

        F_exN₂ = 1 - F_exCO₂ - F_exO₂ - F_exH₂O。

       3）由N₂测试实际输出体积计算N₂理论输出体积

       输入气流体积用V_in表示，输入N₂初始体积为V_inN₂，则V_inN₂=V_in* F_inN₂；

       同理，输出气体体积用V_ex表示，输出N₂的体积为V_exN₂，则V_exN₂=V_ex* F_exN₂。

       N₂的量在输入、输出气体中理应相等，即V_in* F_inN₂ = V_ex* F_exN₂。则N2的理论输出体积V_exN₂ = V_inN₂* (F_inN₂/F_exN₂)。

       无论是输入气流还是输出气流中，而的分布是均匀的。因此，N2在输入气流中体积等于整个输入气流之体积，而代谢后应输出气流中N2理论体积V_exN₂即测试气体的理论体积V_ex（公式中Vin即系统默认采样气流体积，是已知的）。

       4）O₂、CO₂理论输出体积计算

       V_in与F_inCO₂、F_inO₂对应，得到V_inO₂ = V_in* F_inO₂，V_inCO₂ = V_in* F_inCO₂；

       V_ex与F_exCO₂、F_exO₂对应，得到V_exO₂ = V_ex* F_exO₂，V_exCO₂ =  V_ex* F_exCO₂；

       5）完成RER计算

       VO₂ = V_inO₂ - V_exO₂，VCO₂ = V_exCO₂ - V_inCO₂。

       RER = VCO₂/ VO₂= (V_exCO₂ - V_inCO₂)/(V_inO₂ - V_exO₂)。

（待续）。