瞬息凉炎代谢频——动物能量代谢分析系统实验应用问题的讨论

一、间接量热法动物能量代谢分析系统实验应用发文情况

       19世纪上半叶，俄国化学家赫斯（G.H. Hess）从热化学研究中得出能量转化与守恒定律（(law of constant heat sums，即热力学第一定律）：同一种化学反应中热和功的总量，只取决于反应体系的始、末状态，与反应的途径无关。

       动物的生命是由催化燃烧驱动的一种复杂的“生命之火”。根据Hess定律，低温生物“火”所释放的热量与在弹式量热仪（bomb calorimeter）中高温剧烈燃烧等量食物产生的热量相同。就是说，一般化学反应的基本规律，同样适用于人动物体内营养物质氧化供能的反应。譬如，在动物体内氧化1 mol葡萄糖，同在体外氧化燃烧1mol葡萄糖一样，都是要消耗6 mol O₂、同时产生6 mol CO₂和6 mol H₂O，而且产生的热量也相等。因此，测定一定时间内机体所消耗的食物，或检测机体所产生的热量与所做的外功，即可测算出机体单位时间内所消耗的能量（energy expenditure/EE，能量代谢率）。

       故测定机体代谢释放的热量可有直接量热法和间接量热法两种技术途径。

       直接量热法（direct calorimetry, DC）是测定在特定时间内整个机体向外界释放的总热量，其中包括在测定期间机体对外所做的机械功（折算为热量值后一并计入总热值）。该方法虽然最直接准确，但所需技术设备、实验条件复杂，难以实现批量规模化操作。

       间接量热法（indirect calorimetry，IC）的理论依据是能量守恒和物质守恒两大定律：能量代谢的初始底物、最终代谢产物相同，则代谢产生的热量相同，反应消耗的底物（如1 mol葡萄糖）、所需氧气（6 mol O₂）、最终氧化产物（6 mol CO₂和6 mol H₂O）相同，底物与产物存在定比。间接量热法无须直接检测机体所释放的热量，而是通过测定释热反应所消耗O2量、反应终产物CO₂（和/或H₂O）的产量，结合蛋白质的消耗比例，通过Weir公式即可计算出代谢过程产生的总热量。

       间接量热法测试简便易行，只需高精度气体传感器和小型化简单舱室即可完成，技术路线成熟且具有高通量优势。IC不仅特别适合动物实验采用，也被应用于人体代谢监测。德国TSE公司PhenoMaster NG Metabolic and Behavioral Phenotyping System（代谢与行为表型系统）、美国Sable公司Promethion Core Behavioral and Metabolic Phenotyping Systems及美国Columbus公司Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS，综合实验动物监测系统)都属基于IC原理的小动物能量代谢监测系统。

       依托这些测试平台开展实验的报道，最早见于2009年马普衰老生物学研究所&科隆大学Jens C. Brüning研究团队关于中枢神经系统TLR-4/MyD88信号传导通路对饮食诱导肥胖调控机制研究的论文。国内山东大学附属山东省立医院（Sci Rep. 2016）、中国农业大学动物科技学院（J Anim Sci. 2018）较早开展了这方面的动物实验研究，且已有公开成果发表。                                                  

        (PubMed期刊数据库检索时间2023-01-03。查询关键词为：PhenoMaster[Text Word] AND TSE[Text Word]、Promethion [Text Word] AND Sable[Text Word]、Promethion[Text Word] AND SSI[Text Word]、Oxymax CLAMS[Text Word] AND Columbus[Text Word]；PubDate：～2022-12-31)

       数据显示， 2015年以来，间接量热法能量代谢分析系统应用的实验发文开始呈快速增长势头。2020-2022三年间，IFoid打分5分以上期刊有关发文总数为448篇。仅2022年，IFoid分大于10.0期刊发表的上述品牌动物能量代谢分析系统有关的实验论文55篇。

表1 TSE、Sable和Columbus品牌动物能量代谢分析系统2022年高分刊文列举

           (注：IFoid数据引自https://sci.justscience.cn)

       这55个采用能量代谢分析系统测试数据实验研究项目，大致可归入系统代谢调控、脂肪产热机制、脂肪代谢疾病等8个方向。其中，米色脂肪（beige adipose tissue）的生成(Qiang Wang, et al. Nature. 2022；609(7925))和代谢产热（thermogenesis）(Birte Niemann, et al. Nature. 2022；609(7926))、肥胖症是研究热点。

       整体能量代谢调控机制研究则涉及多个维度，包括中枢神经系统（如生物钟、伏隔核）异常、内分泌异常（如甲状腺功能减退）、代谢相关基因突变（如COX7a2L基因变异）、寒冷暴露、糖皮质激素药物等临床药物代谢副作用等。

二、动物能量代谢分析系统核心测试指标

       机体依靠呼吸功能从外界吸入0₂供组织细胞营养物质氧化分解，为生命活动提供能量，同时将代谢终产物C0₂和H20呼出体外。特定时间内，机体能量代谢的二氧化碳产量(carbon dioxide production, VC0₂)与耗氧量(oxygen consumption, VO₂)的比值VC0₂/V0₂，命名为呼吸熵（Respiratory Quotient, RQ）。

       糖、脂肪和蛋白质，由于C、H、O三种元素组成比例不同，完全氧化所产生的C0₂、H20与消耗的0₂耗氧量存在巨大差异，RQ值因而各不相同。

       碳水化合物分子中碳和氧的比例相等，氧化时消耗的0₂与产生C0₂分子数相等。以葡萄糖为例：C₆H₁₂O₆ + 6 0₂ → 6 C0₂ + 6 H₂O，故RQ (glucose) = 6 C0₂/6 0₂ = 1。

       脂肪分子中的氧对碳、氢原子的比例比糖少，故要消耗更多外部提供的氧气。

       以三油酸甘油酯(triolein)为例：C₅₇H₁₀₄O₆ + 80 0₂ → 57 C0₂ + 52 H₂O，RQ (triolein) = 57 C0₂/80 0₂ = 0.71。

       再如三棕榈酸甘油酯(Tripalmitin)的氧化：2 (C₅₁H₉₈O₆) + 145 0₂ → 102 C0₂ + 98 H₂O，RQ (tripalmitin) = 102 C0₂/145 0₂ = 0.7。

       蛋白质的氧化分解产热是根据碳和氢的组成比例计算得到的，RQ理论值为0.80。

       根据呼吸气体交换数据VC0₂、V0₂，计算出RQ值，代入Weir公示即可获得代谢能量消耗(energy expenditure, EE)值。

       公式中：EE单位为kcal/h，V0₂单位为L/h，P是蛋白质代谢产能贡献占总EE的比例（一般情况下，健康机体活动所需热量供应主要源于糖水化合物和少量储备脂肪氧化，蛋白质的氧化供能所占比例近乎于0），V0₂及VC0₂均为按标准温度/大气压/湿度（standard temperature and pressure, dry, STPD)归一化的校正值。

       有了V0₂、VC0₂，就可实现EE的精确定量。

       小动物能量代谢分析系统的代谢测试指标中，常用气体交换比率(Respiratory exchange ratio, RER)指代RQ，以Heat表示EE。

       ［0₂ concentration］：指输入测试笼(box or cage)的空气的0₂分压，它与输入对照空测试笼（reference）气流0₂氧分压（incurrent fractional oxygen, Fi0₂）完全对等；

       ［dC0₂］：指从测试笼抽取的经动物呼吸后，输出气流O2氧分压（excurrent fractional oxygen, Fe0₂）与对照笼输入气流的氧分压之差（FiO2 minus Fe0₂，即ΔF0₂）实测值；

       ［V0₂］：指［dC0₂］转换为以mL/h为单位的计算值；

       ［Flow］、［Temp］：分别指输入测试笼或从笼中抽吸气流的流速和笼内实时温度。系统自动将测试气流中采样气体体积进行STPD归一化处理。

       测试笼气流流速越大，动物呼吸交换后的C0₂、0₂在笼内作无序对流、扩散和积聚越少，可更有效地被“冲刷”带出笼外，越有利于消除、降低呼吸交换气流与测试采样气流之间的滞后效应，避免因C0₂浓度在笼内局部的积聚、扩散影响静息代谢率（resting energy expenditure, REE.是指机体禁食2h以上并在合适温度下平静/卧休息后的静息能量消耗）、活动代谢率（AEE）指标测试准确性，越易于实现实时监测、多指标间同步效果。因此，业界对间接量热法代谢气体分析测试有统一标准：气流流速需满足1小时内实现4轮测试笼内气体完全更新的要求。有一专用词汇叫笼时间常数（cage time constant），是指测试笼内气体全部更新一遍所需的时间。它由笼内有效气体容积、工作气体流速决定。常数值小换气速度快。

       气流流速应针对不同测试笼内部容积、有效空间差异进行必要优化，以确保达标。资料显示，Sable Promethion Core系统可实现最高2000ml/min的气体流速。

       不同测试系统的测试过程中数据模块采集界面、数据分析模块工作界面，所显示的指标略有差异，但后台控制系统执行的采样参数基本一致。

        TSE PhenoMaster NG系统的PhenoMaster Software程序界面，V0₂、RER分别以蓝色、绿色曲线呈现。

       从Columbus的Oxymax CLAMS系统的实验设置界面可以看出，系统显示代谢参数包含了0₂IN（即Fi0₂），0₂OUT（即Fe0₂），D0₂，V0₂，C0₂IN，C0₂OUT，DC0₂，VC0₂，RER、Heat，Flow这一系列核心功能指数。此外，还提供了ACC0₂（0₂累计消耗量）、ACCC0₂（C0₂累计消耗量）两项指标。

       Sable Promethion Core系统代谢模块实时自动采集每个测试动物的V0₂、VC0₂原始数据，计算RQ并实时显示EE动态曲线。实验者可通过系统的电脑工作站本地方式，或通过IM3软件模块从移动设备等远程模式，实时操作和坚持、分析V0₂、VC0₂、RQ和EE数据。

三、动物能量代谢分析系统的常规应用类型

3.1 动物能量代谢状态的监测

       通过监测的V0₂、VC0₂和EE数据结合动物活动水平数据，可以直观地比较不同实验干预分组动物的能量代谢水平。

      如一项由Beth Israel Deaconess医疗中心&哈佛医学院、西安交通大学共同完成的关于PR结构域蛋白16 (PR domain-containing 16, PRDM16)稳定性对米色脂肪产生（beige fat biogenesis）的影响及机制研究证实，cullin-RING家族成员CUL2在脂肪细胞中的过表达CUL2时，可降低PRDM16蛋白的稳定性。CUL2-APPBP2作为泛素 E3 连接酶，催化PRDM16多泛素化。脂肪组织中CUL2–APPBP2表达升高，通过降解PRDM16蛋白而抑制脂肪细胞产热。而抑制CUL2–APPBP2则可延长PRDM16蛋白的半衰期，并促进了米色脂肪产生。CUL2、Appbp2基因敲除小鼠均可出现PRDM16的多泛素化水平降低，显著延长PRDM16的半衰期。对脂肪特异性Appbp2-KO小鼠（Adipo-Appbp2-KO）敲除小鼠的代谢表型分析显示：在正常饮食下，与对照组相比，Adipo-Appbp2-KO小鼠的V0₂增加、呼吸交换比（VC0₂ / V0₂）降低，但未出现体重差异，且表现出适度的高耐寒性。说明在高脂喂养后，基因敲除小鼠的能量消耗显著高于对照组。因此，研究证实PRDM16蛋白稳定可实现代谢健康状态的改善、UCP1介导的米色脂肪产热。

3.2 动物能量代谢底物的分析

       机体的RQ值由特定时间内主要能量代谢组份决定。一般情况下，能量来源主要是碳水化合物，RQ=1.00。若动物采用高脂喂食(high-fat diet，HFD)实验，或正常喂食模式下运动时间过长（如长跑）、剧烈运动或诸如冷挑战实验（cold-challenge experiments）这类高热量消耗，需动用储备脂肪产热的条件下，则RQ值低至0.71 - 0.80之间。在长期饥饿情况下，动物体内的碳水化合物与脂肪耗竭，或进行实验动物长期高蛋白膳食(high protein diet，HPD)实验，机体的能量主要来自蛋白质的分解，则RQ≈0.80。

       因此，根据RQ值可分析特定时间动物机体代谢产生能量所消耗的底物种类。

       测量RQ值可以反映特殊疾病模型、特殊用药群体的营养状态。如糖尿病模型、肌营养不良症、脂肪营养不良综合征、肿瘤恶病质等，因体内脂肪消耗而往往呈现RQ的降低。RQ值回升到0.81 - 1.00，提示营养改善后机体能量代谢逐步恢复。

参考文献

［1］Karl J. Kaiyala, Brent E. Wisse, John R. B. Lighton. Validation of an equation for energy expenditure that does not require the respiratory quotient. PLoS One. 2019; 14(2): e0211585.

［2］Qiang Wang, Huixia Li, Kazuki Tajima, et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 2022; 609(7925): 151–158.

［3］Janane F. Rahbani, Charlotte Scholtes, Damien M. Lagarde, et al. ADRA1A–Gαq signalling potentiates adipocyte thermogenesis through CKB and TNAP. Nat Metab. 2022; 4(11): 1459–1473.

［4］Birte Niemann, Saskia Haufs-Brusberg, Laura Puetz, et al. Apoptotic brown adipocytes enhance energy expenditure via extracellular inosine. Nature. 2022; 609(7926): 361–368.

［5］Rafal Czapiewski, Dzmitry G. Batrakou, Jose I. de las Heras, et al. Genomic loci mispositioning in Tmem120a knockout mice yields latent lipodystrophy. Nat Commun. 2022; 13: 321.