产品课堂
瞬息凉炎代谢频——动物能量代谢分析系统消除水蒸气稀释效应的技术途径(下)
(续：瞬息凉炎代谢频——动物能量代谢分析系统消除水蒸气稀释效应的技术途径-上篇)
三、讨论
通常，动物能量代谢监测系统分别采集测试笼内气体（测试气样）、室内空气（对照气样），对比两组气体中O2、CO2各自含量变化来测算一定时间内代谢所消耗的氧气VO2和产生的二氧化碳VCO2。
笼内气体经过呼吸气体交换后，在部分O2被消耗的同时，动物呼出的CO2+H2O总量更多，不仅填补了损耗O2的体积亏空，还促进待测气体总量和总体积的净增长。理论上，最终输送至O2、CO2气体分析仪的测试气体流量（输出流量）要大于对照气体、输入气体的流量。如此，方可确保输出气流载入的气体与输入气流具有等效性，真实、准确地衡量初始输入气流与代谢后输出气流中CO2、O2含量实际发生的变化。
为确保输入、输出气流组分的等效性，需设定采样内部参照标准（内参）。内参气体须在呼吸交换前后自身总量维持稳定，根据阿伏伽德罗定律，其总体积自然保持恒定。空气中的N2等不参与呼吸代谢交换的气体组份，无疑是最简便、最可靠的内参选择。系统无须增加专用的气体传感器，利用系统自带的高精度O2、CO2和水蒸气气体分压测定值，采用道尔顿气体分压原理和系统已知的标准采样流量，即可间接测算出N2等非代谢气体的总体积。将N2总体积在对照气体（等效于输入气体）、实际采集合测试气体（非理论输出体积）中体积的比值作为校准因子，结合实际测试采样中O2、CO2气体分压数据，即可还原理论输出气体中O2、CO2各自含量或体积，从而实现了输入、输入气流的两种气体含量的准确测定。Sable Promethion Core系统中采用的正是这一思路实现测试采样气体流量的校正。这一流量校正方法，水蒸气不仅无须净化，反而是尽力保全的重点测试对象之一。其间，离不开气压分析仪和水蒸气分压测定。毫无疑问，基于水O2、CO2和水蒸气的气体分压测定和体系中非代谢气体N2质量守恒原理创立的测试输出气流一步式补偿校正方法，是一个简便精准O2、CO2测定的解决方案。
换个角度看，无是测试气流、对照气流，无非都是由水蒸气和非水蒸气组分两部分构成的。对于先除湿后检测的动物能量代谢分析系统，如Columbus CLAMS、TSE PhenoMaster NG等，假设对照空气中水蒸气体积占比0.03%，实际采样测试气流的水蒸气体积占比2.03%，则干燥处理后，对照气体、测试气体剩余非水蒸气类气体的总量分别相当于处理前的99.7%和97.97%。以对照气体非水蒸气组份气体为参照，则测试采样气流量只相当于对照气流之98.26%，不具有等效性。当输入气体检测舱时，测试气样被自然稀释，造成O2、CO2测试误差。因此，采用水蒸气净化处理的话，必需校正测试采样气流或同时对对照气流实施流量校正控制。校正的标准是两组气体干燥后气体的气压或气体流量测定值的一致。采用的方法是在气体净化单元之后增加气体校正单元，在干燥处理的同时，将测试气流或同时对照气流采取适当的采样量补偿控制，以确保被所剩余的非水蒸气气体组分含量等效性。而有效的补偿采样流量控制，不仅是测试结果可靠性的关键，还会增加系统结构之复杂性。
可见，能量代谢分析系统中呼吸气体交换率测定数据有效性、准确性的关键，不在于水蒸气的稀释效应有无和严重程度，而在于测试气体采样流量的精密校正机制。去除水蒸气的稀释效应，并非代谢气体分析实验的必然之路。
结合本文前面的讨论，可以认为：水蒸气干燥处理并非动物能量代谢RER测定的必要条件。无论是TSE PhenoMaster NG系统的干燥-采样流量校正方法，还是Sable Promethion Core测试气体流量补偿校正技术，只要补偿的采样气体流量适度，都是可行的。另外，水蒸气稀释效应只是业内约定成俗的概念，其涵义不明确且存在片面性，实际上在动物能量代谢呼吸气体的测定中不具有任何指导意义。因此，我们主张从采样气体流量校正技术方法角度，来理解和探讨RER分析测试中不同品牌动物代谢气体监测系统技术设计上的差异，似乎对开发、完善这类技术设备测试性能更有启迪价值。
3.1 TSE PhenoMaster NG的低温冷阱除湿法
通常，冷阱的工作温度越低，其捕获水蒸气的效能越高。常规实验室小型冻干机的冷阱额定温度，根据实验样品要求可在-20℃ ～ -104℃的大范围内自由选择。如德国Christ ALPHA 1-2LD Plus，冷冻搁板温度可达-20℃，可实现最大凝冰效率2kg/24h。
而动物能量代谢和行为表型分析系统，为确保呼吸交换气体测试值、动物饮食饮水、动物行为状态和模式监测等众多代谢有关测试数据有效关联，需气体冷凝足够高效，以改进代谢气体监测数据产生上的延迟滞后现象，实现动物行为表型与RER监测数据的真正协调和同步化。
低温冷阱装置在于室温空气热交换的过程中持续对外散热。额定工作温度降低侯，制冷功耗和热量排放和运行噪音水平均会水涨船高。但动物代谢监测实验对环境的室内气压和温度条件的稳定、室内噪音水平控制都都有特殊要求，以减少对测试动物代谢和行为表型的干扰。而这势必会对选择更低温度冷阱形成制约。
空气热传导性相对较差，在冷阱冷凝性能不够强悍的情况下，室温水蒸气冷凝干燥处理，若无足够时间热量交换时间，则水蒸气净化效能难以保证。这使得提升系统监测数据实时同步化表现，面临极大的困难。
TSE PhenoMaster NG采用低温冷阱除湿方法的优势是：运行过程中的低维护、免耗材。
3.2 Columbus CLAMS的化学洗涤除湿法
CLAMS Oxymax模块除水蒸气用的是Drierite品牌带CoCL2指示剂的无水硫酸钙填装柱。水蒸气气流流过干燥住的过程耗时相对较长，其次是水分子与干燥剂的吸附、解吸附过程是双向变化的，在使用过程中，随着有效吸附表面积的减少，水汽净化柱效下降的问题。
使用单根Drierite 干燥柱效用持续时间短。若两根Drierite 干燥柱串联使用在可将柱效持续时间延长到72小时。但随之而来的问题是，串联净化柱的使用，必然使采样气体通过柱体的时间进一步延长。
因此，与TSE PhenoMaster NG系统采用的冷阱除湿法类似，Columbus CLAMS系统的不仅会存在气体监测数据与其它代谢关联数据高度同步化的难题，还有可能加剧气体监测数据与其他数据不同步现象。
Drierite净化柱采用外置接入，使用维护经济简便，但需运行期间需定期检查状态活性状态，以免影响除湿效果。
干燥住中的指示剂容易CoCL2与测试笼内动物尿液尿素分解释放的NH3会发生反应而变色。因此，在Drierite干燥柱前还需加装氨气捕获阱（Ammonia Traps，主要成分为CuSO2·5H2O）保护水汽净化柱。
3.3 Sable Promethion Core之气体流量补偿校正法
根据阿伏伽德罗定律(Avogadro's Hypothesis)，相同温度、相同气压下，气体体积比等于物质的量之比（气体体积与量成正比），或者说同温同压下相同体积的任何气体含有相同的分子数。
Sable公司基于代谢呼吸交换气体中非水蒸气组份气体的量和体积变化规律，摒弃了对水蒸气净化排除处理的常规思维，运用CO2、O2和水蒸气气体分压数据，计算代谢前后测试气流非水蒸气组分气体体积的变化，运用简单的计算方法校正测试采样气体流量，实现了CO2、O2气体量、体积变化的精确测定。
Promethion Core系统的测试采样气路中不使用水蒸气化学洗涤柱，不等于Promethion Core系统绝对排除了气体洗涤器技术的应用。
实际上，CGF模块安装有气体洗涤柱，专门用于对CO2、O2和水蒸气监测传感器的自动校正环节。校准时，除湿柱被切换到气路中用于去除气流中的水蒸气（此时，标定水蒸气分压值为0）。基于同样的原理，分别采用CO2、O2气体洗涤器柱去除气流中的CO2、O2后，可实现气体分析仪的CO2、O2归询价校正。
3.4 测试气体流量校正方法应用对系统结构布局的影响
动物能量代谢分析系统在呼吸交换气体监测中对水蒸气处置策略的不同，决定了系统是否需要在测试气路中引入水蒸气处理环节。而一经导入气体除湿单元，为应对采样气流中水蒸气所占气体体积空缺后剩余气体浓度稀释产生的误差，就得在测试采样控制单元-气体干燥单元流程后面额外增加一个气体流量采集的调控实体模块（如TSE PhenoMaster NG系统气体流量校正控制单元），解决气体干燥处理后有效测试气体流量间差异问题。因此，采用水蒸气净化流量校正法的系统，各功能单元相互独立，呈积木式、多模块分散式布局，模块间气路和数据通讯传输线路纵横交错，需要大型控制机架来安装承载各监测模块。
Promethion Core 系统的CGF控制单元的高度集成化，通过一套刀片式气体压力检测模块，基于CO2、O2和水蒸气的气压数据，结合程序化算法自动校正采样气体流量，完成RER测算。
该方法省去了物理、化学除湿环节时间消耗，气体监测过程得到极大简化，实现RER指标相关数据以及动物各细微动作行为表型、动物状态的高度同步化。结合SableHD高分辨采样技术，提供高分辨率、采样率和准确性的代谢和行为测量数据，特别有利于捕捉代谢率过程突然变化细节（如从静息转换到运动状态），准确地记录快速变化事件，便于研究者更清楚地掌握代谢和行为的精细过程。此外，还降低了常规化学试剂消耗与维护成本。
Promethion Core 系统无须TSE PhenoMaster NG、Columbus CLAMS系统那样使用复杂的水蒸气净化部件和校正控制组件，极大简化整套系统布局结构，实现系统硬件小型化，节省实验空间。
参考文献
[1] Karl J. Kaiyala, Brent E. Wisse, John R. B. Lighton. Validation of an equation for energy expenditure that does not require the respiratory quotient. PLoS One. 2019; 14(2): e0211585.
[2] Lighton JR, Halsey LG. Flow-through respirometry applied to chamber systems: pros and cons, hints and tips. Comparative biochemistry and physiology. 2011. March;158(3):265–75.
[3] CLAMS Oxymax Model 2018 Hardware Setup Manual
[4] PhenoMaster Calorimetry Hardware Operating Instructions (PM15_HW_CaloSys_e_01)
