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故书百回读深思子自知——MIQE指南对qPCR实验中核酸紫外测定的要求-上
在影响实时定量反应检测灵敏度、准确性和可靠性的众多因素中，核酸模板品质与含量无疑具有决定性作用。核酸品质（quality）是指核酸的纯度（DNA/RNA、蛋白质、酚等PCR抑制剂的残留）和完整性（Integrity）符合要求并保持稳定。核酸的量是指用于反应的ng或μg核酸质量或拷贝数。基因表达定量分析中，加入相同质量的总RNA、确保每个qPCR反应孔的cDNA模板含量均一，以确保测试值真实反映mRNA 实际水平差异、排除因cDNA用量不同所致误差。SNP基因分型检测中模板数量过少将影响等位基因数据有效性。而NGS测序前对测序文库模板数量均一化是保证数据质量不可或缺的质控手段。
2009年发布的定量PCR实验数据发表所必需实验信息最低限度标准(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) ，即MIQE指南，明确了qPCR实验发表时作者所需提供的最低信息标准，以保证实验数据的正确性、准确性和实验结果的可重复性。指南从qPCR样本的采集、处理和制备，核酸质量控制，反转录、qPCR体系设定及数据分析的各环节具体要求都有详尽阐述，为全球生命科学与生物医学的国际化标准《生物和生物医学调查的最小信息》(Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations, MIBBI)的重要组件。
本文围绕MIQE指南的核酸质量控制环节中与微量紫外可见光度计应用有关的论述内容，结合目前学术期刊qPCR实验文章所披露的实际操作办法，探讨如何在qPCR实验流程核酸质控中充分发挥微量紫外可见分光光度计测定功能的问题。
一、核酸品质对实时荧光定量PCR测试性能的影响
MIQE指南中的核酸质量控制(QC of Nucleic Acids)首先是指核酸模板的完整性（integrity，是指核酸特别是RNA的降解程度）、纯净度（核酸样品中其他核酸模板可能干扰测定结果、抑制逆转录活性或PCR反应的污染物的残留情况）的评估。其次，是qPCR反应过程核酸数量的测定和控制。
1.1 完整无降解的RNA模版是qRT-PCR结果可靠性的关键
mRNA与机体所受内外环境条件刺激和生理状态息息相关，其含量具高度动态性。组织器官生理结构、取样的时间和材料的管理环节的差异同样影响RNA的降解。降解引起的基因转录水平相对差异可能会对实验结果的评价产生误导。
在RNA完整性对RT-qPCR检测性能影响的评价实验中，用酶消化或紫外线处理的方法降解从牛组织中提取的完整RNA后，对18S rRNA、28S rRNA、β-Actin、IL-1b基因表达mRNA的测定结果显示，来自同一组织的完整RNA和降解RNA样本之间，测试值的稳定性存在显著差异。从高丰度18S和28S rRNA，中等丰度的β-Actin，到极低丰度的IL-1b，出现随着RNA品质提升而mRNA样本定量结果变异性 (intraassay variation)降低的现象。
RNA完整性具有组织细胞依赖性、时间特异性和基因特异性。一般认为，结缔组织含量高的组织（如胃肠道）、富含RNase的器官（如胰脏），在取样、存储过程中RNA降解较高；细胞来源RNA样品完整性要好于从实体组织提取的RNA。
研究显示，降解RNA样本测试数据变异存在高度的组织、基因特异性。某些组织中mRNA定量似乎不受RNA降解的影响，从部分降解的RNA样本获得的基因表达谱与完整RNA样本相比，具有高度相似性。但有些组织mRNA数量与RNA质量评分指数RIN存在线性关系或存在RIN指数阈值响应关系（即部分样品无法给出准确的测定结果）。
MIQE指南总结为：扩增片段长达400bp时，扩增效果强烈依赖于优质RNA。而多数情况下，即便对70-250bp短扩增子qPCR测定，耐受RNA降解程度的能力也不尽相同（即RNA完整性受损不是啥好事）。定量RT-PCR分析，高品质RNA可纵横捭阖、畅行无阻，而部分降解的RNA适合于短扩增子反应。因此，想要准确地量化组间微小表达差异，在定量分析前验证和审视RNA质量是有益的且极其重要。
1.2 RNA品质对qRT-PCR扩增效率的影响
即使是完整RNA、优化的引物及反应体系， 若RNA样品中PCR抑制物浓度过高，同样会降低qPCR检测灵敏度和扩增效率。
通常，人们用靶基因与内参基因平行扩增和用内参对靶基因测试值归一化的处理方法来解释样本间定量差异。无论相对定量还是绝对定量分析，其前体都是假设这靶、参的扩增受到相同的抑制程度。但实际情况是，部分生物样本可能含有的PCR抑制剂，在内参样本中不存在，而据此构建的标准曲线作为定量基准，导致测试样本中mRNA水平低估，从而扭曲归一化和定量分析结果。
包括生物样品自身的天然组分、核酸提取纯化操作用的试剂和实验器具携带的各种化合物，凡是影响DNA聚合酶的活性，干扰模板与DNA聚合酶及引物的结合，抑制PCR扩增的化合物、盐分，均视为为PCR抑制剂。
表1 实时荧光定量PCR实验常见PCR反应抑制物
干扰物类型 | 污染来源 | 常见污染物 |
内源性干扰物 (endogenous interferent） | 血 液 | 血红蛋白(>1mg/mL)，氯高铁血红素(Hemin) (>0.1 ng/μL)，免疫球蛋白G(IgG)； 甘油三酯（TG）、铁离子、胆红素等 |
动物组织 | 蛋白酶、肌红蛋白、胶原质、黑色素、脂肪、糖原、胆汁盐酸； 基因组DNA浓度和DNA结合蛋白等 | |
植物组织 | 腐殖酸(50ng/μL)、丹宁酸/鞣酸(Tannic acid)(0.1ng/μL)、多糖、多酚等 | |
药 物 | 抗生素、抗病毒药、激素类等 | |
牛奶骨头 | 蛋白酶、ca2+等 | |
尿 液 | 尿素(>20mM) | |
粪 便 | 植物多糖、胆酸盐等 | |
外源性干扰物 (exogenous interferent) | 提取试剂 | 硫氰酸胍、盐酸胍、苯酚(>0.2%)、氯仿、十二烷基硫酸钠(SDS) (>0.005%)等 |
有机溶剂 | 异丙醇(>0.15 IU/mL)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺(DMF)、甘油、聚乙二醇(PEG) ； 乙酸钠(>5mM)、溴酚兰等 | |
抗 凝 剂 | 肝素(>0.1U/mL)、乙二胺四乙酸(EDTA) (>0.5 mM)等 | |
消 毒 剂 | 醇类/乙醇(>1%)、酚类/苯酚(>0.2%)、过氧化物类、强酸HCL、强碱NaOH等 | |
土壤植物 | 矿物质、有机质、腐殖质等 | |
实验器具 | 紫外线照射老化的聚丙烯材质样品管、样本采集容器、一次性塑胶手套上的滑石粉等 |
国外的一项专门调查表明，约6%的研究人员关注了实验所用核酸样本是否存在抑制剂的问题。
二、MIQE指南对qPCR实验中微量紫外可见光度计核酸测定的要求
MIQE指南的MIQE checklist列表中，涉及到紫外可见光度计应用的是核酸提取和反转录两个操作步骤。
虽然列举的是mRNA，但其指则适用的样品，应理解为包括全部DNA（包括基因组DNA、质粒、mtDNA、STR等）和RNA（涵盖组织mRNA、miRNA、lnRNA、shRNA及病毒RNA等）类型样品，应用范围既包括核酸定量，也包揽SNP检测应用。
表中E（essential information）标记项属须与发表文稿一起提交的基本信息（可理解为强制要求）；而D（Desirable information）标记项为根据实验条件尽可能提交的资料。
表2 实时荧光定量PCR实验核酸质量控制的MIQE checklist
Item to check(应检查的项目) | Importance |
Nucleic acid extraction（核酸提取步骤） | |
Procedure and/or instrumentation（核酸提取程序和/或所用仪器） | E |
Name of kit and details of any modifications（核酸提取试剂盒及一切操作改动） | E |
Details of DNase or RNase treatment（DNase或RNase处理的细节） | E |
Contamination assessment (DNA or RNA)（DNA或RNA污染评估过程） | E |
Nucleic acid quantification（核酸定量） | E |
Instrument and method（核酸定量所用仪器和方法） | E |
RNA integrity: method/instrument（RNA完整性检测方法/所用仪器） | E |
RIN/RQI or Cq of 3' and 5' transcripts（RNA的RIN或RQI值或Cq的3’和5’转录本） | E |
Inhibition testing (Cq dilutions, spike, or other)（PCR抑制测试情况Cq稀释度、峰值等） | E |
Source of additional reagents used（核酸提取所用额外试剂的来源） | D |
Purity (A260/A280)（核酸的A260/A280纯度检测） | D |
Yield（核酸产量） | D |
Electrophoresis traces（凝胶电泳检测结果） | D |
Reverse transcription（反转录步骤） | |
Complete reaction conditions（RT完整反应条件） | E |
Amount of RNA and reaction volume（RNA用量和反应体系体积） | E |
Priming oligonucleotide (if using GSP) and concentration（寡核苷酸引物和浓度） | E |
Reverse transcriptase and concentration（反转录酶及其浓度） | E |
Temperature and time（RT反应的温度和时间） | E |
Manufacturer of reagents and catalogue numbers（RT试剂的厂商和货号） | D |
Storage conditions of cDNA（cDNA保存条件） | D |
Cqs with and without reverse transcription（RT后样品和未进行RT的样品的Cq值比较） | D |
综合表2内容和QC of Nucleic Acids一节的论述，MIQE指南对qPCR实验中用微量紫外可见光度计进行核酸测定的目的、要素和要求，大致可归纳为以下几点。
2.1 核酸样品污染情况评估
MIQE指南规定，qPCR实验须报告所用核酸样品中的基因组DNA/RNA、苯酚及其他PCR反应抑制剂残留的评估情况。而紫外可见光度计的A260/A280比值测定是一简便而重要的评估方法。其理论依据是：在中性pH溶液中测量核酸样品，高纯度的RNA溶液的A260/A280比值为2.0，而DNA这一比值为1.8，苯酚的紫外吸收峰为270nm。如RNA样品中存在基因组DNA的混入（降低A260读数）或苯酚残留，抬升A280测试值，导致RNA的A260 /A280比值降低。
2.2 核酸的含量测定
在qPCR实验要比较不同靶标定量的结果，首先要确保qPCR实验流程几个关键环节核酸样品中的总RNA、cDNA、DNA模板用量大致相同。因此，紫外可见分光光度计A260测定核酸浓度为必选动作。
MIQE指南的有关内容有：
1）核酸（DNA/RNA）提取产量（注：测定所获的高品质核酸OD值，根据dsDNA、RNA的μg/ μL浓度及提取物总体积计算核酸提取总产量，便于分配后续各项应用中核酸用量）；
2）反转录时总RNA用量（注：市面反转录试剂盒常建议按RT反应体系20μL：2μg总 RNA的投料比例配置RT反应体系）；
3）qPCR反应核酸模板定量（DNA/cDNA）定量（注：不同基因的cDNA合成效率不一，通常RT试剂盒无法给出cDNA产量值。A260测定获得高品质cDNA产物浓度和总产量，便于规划qPCR反应的cDNA用量）；
4）qPCR反应寡核苷酸引物/探针浓度测定（根据引物合成厂家配套说明和实际A260测定结果，基于cDNA投料量来优化反应体系中引物体积用量，确保扩增效率和扩增特异性）；
5）核酸测定所用仪器及方法
指南中，NanoDrop微量紫外可见分光光度计作为把核酸定量的首选方法。低浓度RNA样品测定则推荐荧光RNA结合染料法（如RiboGreen和Qubit 系列荧光计）。(待续)
