故书百回读深思子自知——MIQE指南对qPCR实验中核酸紫外测定的要求-下

 （续:MIQE指南对qPCR实验中核酸紫外测定的要求-上）

三、实时荧光定量PCR实验MIQE核酸质控规则的实际运用

       资料显示，如同MIQE指南本身在国际学术期刊的文稿发表审稿环节实际贯彻落实情况的遭遇，不同期刊对文章qPCR实验checklist的要求并不一致。整体上，按文章中对核酸质量控制过程细节披露的详略不同，常见3种情形。

3.1用心良苦型

       皮肤淀粉样变性(Amyloidosis cutis dyschromia, ACD)是主要发生于东亚和东南亚族群的不完全外显的常染色体显性遗传疾病。糖蛋白非转移性基因 B (glycoprotein non-metastatic gene B, GPNM-B)编码的GPNM-B跨膜蛋白，在表皮的黑色素细胞中表达最盛。正常情况下，GPNM B蛋白与自噬蛋白和吞噬小体共定位，参与自噬蛋白被招募到吞噬小体，与溶酶体与吞噬小体融合，促进黑色素小体的形成。ACD个体发生的基因突变造成GPNMB蛋白分子截断、在胞质中显著降解和错误细胞定位，导致对黑色素小体的形成、吞噬作用等负调控功能的缺失，造成 ACD中黑色素失调和淀粉样变。对转染野生型、突变型GPNM B基因cDNA质粒的HeLa细胞中GPNMB mRNA表达水平检测证实，突变体GPNMB mRNA的表达水平明显低于野生型转录本。实验中，NanoDrop 2000（相当于NanoDrop One）被运用于以下操作：

1）从HeLa细胞提取总RNA经DNase处理后的总RNA的纯度(purity) (A260/A280、A260/A230比值)和浓度 (concentration)测定（A260）。其结果为：A260/A280≥1.9，A260/A230≥2，总RNA浓度386–466 ng/μL；

2）取1μg总RNA（约2-3μL提取液）反转录合成cDNA；

3） qPCR反应的cDNA用量：上一步反应合成的cDNA（反转录产物cDNA产量和浓度测定值不详）经10倍稀释后，每孔取2μL稀释cDNA模板，500 nM正、反向引物组, 2× SYBR Green PCR Master Mix在384孔PCR板上构建10 μL反应体系完成RT-qPCR和溶解曲线分析。

GPNM-B基因外显子测序样品的准备过程，同样采用A260/A280、A260/A230比值检验核酸纯度（A260/A280≥1.8, A260/A230≥2）、Qubit 2.0荧光染料法测定DNA浓度，还增加1%琼脂糖凝胶电泳分析步骤以验证DNA是否存在降解。 

3.2中规中矩型

       这部分刊文的qPCR实验，核酸样品质量评估控制环节，一般通过测定260/280、260/230两项指标来评估所提取的核酸样品的纯度和浓度，测定指标的披露往往被省略。

       由于细胞在3D培养基质支持下悬浮生长比常规2D体外培养更接近在体内真实环境生长细胞所具有的形态、增殖、分化、迁移和基因表达等特征。因此3D细胞培养体系统可用于疾病模型构建、药物筛选、细胞治疗和再生医学研究等领域。采用液滴微流控技术在单个细胞的周围构建起三维水凝胶基质环境，可精确控制细胞周围三维凝胶的沉积量。当间充质基质细胞粘附于较薄凝胶时，其体积扩张得更快，具有更高膜张力和增加成骨分化功能。间充质干细胞成骨分化标志性基因表达分析实验中，RNA质量评估是这的：纯化的总RNA被重悬于15µL RNase-free water (注：模拟中性pH环境)，NanoDrop 测定RNA 的浓度和质量（concentration and quality）；反转录采用Superscript-III reverse transcriptase试剂盒；每个qPCR反应孔为50 ng cDNA用量。

       文中没有披露RNA浓度、质量具体测定指标、测定值、反转录RNA用量。但给出cDNA用量，说明作者是测定cDNA的浓度后再根据吸取体积计算出cDNA含量。

       另一个近红外光免疫疗法(Near-infrared photoimmunotherapy, NIR-PIT)抗肿瘤疗效及机制的研究实验中，用Nanodrop测定260/280、260/230两项比值对肿瘤组织的总RNA纯度和含量(purity and quantity)进行测评；取2μg 的总RNA用含RNase抑制剂的反转录试剂盒合成cDNA。

       这说明实验人员在测定总RNA的A260后，根据仪器给出浓度（μg/μL）值和移液体积计算出反转录总RNA用量。但文中没有提供实时荧光定量反应的cDNA用量，故无法得知是否进行过cDNA浓度的测定。

3.3 一笔带过型

       大量qPCR实验论文中对核酸质量控制过程描述都过于简略，与MIQE指南的要求相距甚远。

       胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)可通过激活2型免疫细胞、增加免Treg细胞数量，诱导皮肤分泌脂肪而减少白脂肪堆积，防止肥胖。2021年发表于Science上的这篇高作披露：在对皮肤18个与人类皮肤皮脂生成相关基因和TSLP基因表达检测分析实验中，用Nanodrop 1000测定了总RNA的含量。

       另一项对新发现的、与外周血T细胞淋巴瘤(Peripheral T-cell lymphoma, PTCL)复发有关的嵌合转录本（基因融合突变而产生的融合基因表达的mRNA）FYN-TRAF3IP2、KHDRBS1-LCK和SIN3A-FOXO1的研究项目中，qPCR反应前用NanoDrop 2000测定了嵌和转录本的浓度和纯度。

       磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1, PGK1）是糖酵解过程的关键酶。敲除pgk1基因，抑制了细胞的糖酵解反应，导致小分子代谢物甲基乙二醛(MGx)的积聚，进而使PGK1近端半胱氨酸和精氨酸残基发生翻译后的修饰，产生了KEAP1二聚体结构，并伴随NRF2的积累和NRF2转录的激活。揭示了KEAP1-NRF2信号转导通路在应激反应条件下的细胞代谢功能调控机制。美国斯克利普斯研究所的大V们用慢病毒载体搭载PGK1、GLO1基因靶向shRNA转染HEK293T细胞进行的基因敲除，靶基因表达验证实验部分，用NanoDrop测定总RNA的浓度后取500ng-5μg用于cDNA的合成。

       类似案例不胜枚举。

       可见，对实时荧光定量PCR反应核酸质量评估环节，紫外吸光度评价法的测定指标，业界认识并不一致。评估方法上重量（Nucleic acid quantification）轻质（Contamination assessment、Purity (A260/A280)）的现象依然十分普遍。

四、讨论

       嘌呤、嘧啶、核苷、寡核苷酸或核酸（DNA和RNA）分子因共同的嘌呤环和嘧啶环共轭双键而具有统一的260nm吸收峰特征。260nm的吸光度与所含DNA和RNA、寡核苷酸（PCR引物、探针）的浓度成正比，这是A260用于核酸定量的基础。蛋白质肽链的色氨酸和酪氨酸残基具有苯环含共轭双键，280nm紫外线吸收峰为其标志，故A280被用于蛋白的紫外测定和计算蛋白浓度。

       在pH中性溶液中，dsDNA的A260/A280比值为1.8；ssDNA、寡核苷酸链和RNA的A260/A280比值为2.0。而溶液含有蛋白质（如各种核酸酶、蛋白酶、血红蛋白、免疫球蛋白等）或酚类残留时，核酸A260/A280比值将低于1.8/2.0。有观点认为：RNA样品的A260/A280比值1.9~2.0属高纯度，1.8~1.9视为轻度蛋白污染，但还可以正常使用；但比值<1.8则视为严重污染，可能干扰后续实验。对于DNA，A260/A280比值＞1.9表明有RNA污染；A260/A280＜1.6，视为蛋白质/苯酚的中度污染。因此，A260测试对应于核酸浓度（concentration）测定，而A260/280比值针对的是核酸纯度（purity），用于评估吸收峰波长260nm以上的蛋白、苯酚类污染程度。

       MIQE指南强调A260、A280测定须在pH中性溶液中进行（溶液的pH值改变引起核酸蛋白分子共轭体系的延长或缩短，使紫外吸收峰偏移，测定值相应发生改变。以RNA溶液为例，酸性环境下报告的A260/A280值可能比2.0要降低0.2-0.3，而碱性环境下的测定值则相反。这是造成不同实验报告中A260/A280、A260/A230比值不同一个不可忽视的重要因素。报告核酸样品测定结果时，注明测试溶液的温度和pH值更有参考价值）。众多文献中的做法是将核酸溶于不含DEPC、RNase的Thermo Scientific RNase-free water中检测。而通常，25℃室温下新鲜超纯水pH值约7.0，是最方便的核酸溶剂来源。

4.1 核酸纯度评估A260/A280之外是否应引入A260/A230？

       讨论这一话题，是因单一A260/A280指标评估核酸纯度的准确性业界一直存有争议。

       首先，因核酸对250nm-270nm范围的消光系数比蛋白质高很多，少量蛋白污染（如人为加入5%蛋白质）对A260/A280比值（处于1.96-1.99区间）影响有限。只有当蛋白质肽链中色氨酸残基（吸收峰为280nm）比例较高，蛋白的混入才会出现A260/A280比值显著改变。纯蛋白样品A260/A280比值为0.57，而只需少量核酸混入即可使比值迅速蹿升至1.0上下。因此，A260/A280比值最适于对蛋白制品中核酸污染评估，作为指示核酸样品中蛋白污染程度并不灵敏。

       其次，苯酚、异硫氰酸胍、PEG等提取试剂、杂质，在230nm、260nm、280nm波长附近均有不同程度光吸收，增加A230、A260和A280测定值，会干扰A260/A280比值。譬如苯酚残留，不仅使A230、A260和A280读数上升。同时，因其吸收峰与核酸吸收峰合并后整体迁移移至270nm附近。表面上样品 260/280 比值接近正常或降低，但样品吸收峰出现在270nm，且存在260/230比值降低现象，实际存在苯酚残留。再如胍盐、糖原和碳水化合物等，有230nm的吸收峰，虽不影响A260、A280读数及260/280比值，但会压低260/230比值。此时样品260/280值达标，但260/230<1.6，污染是存在的。

       尽管因DNA、RNA样品A260/A280比值不同，理论上，基因组DNA残留会使RNA的比值低于2.0。但基于上述各种复杂情况，仅凭A260/A280比值是无法有效确认样品提取过程中基因组DNA的污染及严重程度的。因此，单一A260/A280比值实现对核酸纯度，特别是核酸抑制剂污染的评估，是不全面的。

       克服A260/A280单一指标缺陷的有效办法是核酸样品波长扫描分析。以RNA为例，纯RNA扫描得到的是一平滑曲线：有A230波谷、A260波峰，A320\A340贴近背景基线；A260/A280≈2.0，A260/A230≈2.0，A260/A215≈1.0。

       部分固定波长的微量紫外光度计，如赛默飞的NanoDrop Lite Plus微量紫外光度计(A230/A260/A280)，无法进行全波长扫描，可用A260/A280、A260/A230双比值来评估污染物的残留情况。

       事实上，本文所引文献中就有实验采用的是A260/A280 +A260/A230双比值法。这比SPUD抑制剂测定法，显然更加快捷、经济易行。

4.2 如何评估RNA样品中基因组DNA污染？

       qPCR实验中，反转录合成的cDNA与残留的基因组DNA都可作为PCR模板被扩增，特别是采用SYBR Green染料标记的测试中，残留的DNA荧光信号污染会影响定量数据准确性。因此，去除总RNA中的基因组DNA污染，对于采用RT-qPCR方法进行基因表达定量分析具有特殊必要性。

       而完全依赖A260/A280单一指征对核酸污染评估确有潜在风险。

       由于基因组DNA分子量通常比RNA分子量大得多，在凝胶电泳中迁移率存在明显差异，因此可通过琼脂糖凝胶电泳予以有效分离和鉴定。通常，总RNA中如有基因组DNA残留，DNA条带因为迁移缓慢而滞后于所有RNA条带，在凝胶上表现为在28S rRNA带上方、接近上样孔附件出现新的弥散条带。MIQE指南规定，须记录实验中对RNA样品经何种DNase酶及处理条件这一细节。同时建议实验者提供反转录操作前样品的凝胶电泳分析证据。

       增加琼脂糖凝胶电泳分析，不仅简便易行，还增进核酸质量评估的严谨性和测试结果可靠性。尽管在MIQE指南属于核酸提取操作中D类审查事项，但本文所引用多篇刊文的实验中都采用了该方法。

       A260/A280比值之外，MIQE指南要求记录（测试所用具体方法流程）可耐受基因组DNA污染含量的阈值（the threshold cutoff criteria for the amounts of such contamination that are tolerable.），并报告每个测试靶标核酸样品孔、阳性对照样品（内参对照基因）孔和无逆转录对照孔（只有RNA而无cDNA，可检验RNA样品在经DNase处理后中是否还有基因组DNA的残留）的Cq比较结果（the results from a comparison of Cqs obtained with positive and no-reverse transcription controls for each nucleic acid target.）以证明是否存在基因组DNA污染干扰情形。

4.3 简便易行的核酸样品PCR抑制剂评估建议

       核酸质量评估控制环节还有一审查事项就是PCR抑制剂污染的评估。

       无论是MIQE指南与人们实际工作中执行的做法是一致的，即采用核酸样品连续倍比稀释，根据qPCR标准曲线所计算的PCR扩增效率来证明是否存在PCR抑制剂污染。

       A260/A280 +A260/A230双比值，可视为PCR抑制剂评估的间接证据。

4.5 MIQE指南紫外吸光度法核酸质量评价环节是否有值得商榷之处？

       首先，MIQE checklist表中反转录步骤，用Amount of RNA（RNA质量，即μg或ng质量数）及Priming oligonucleotide concentration都属于必须报告内容，对qPCR反应cDNA/DNA模板用量不作要求，这不合理。因为cDNA转录效率存在一定程度的基因特异性、反应时间依赖性和各厂家试剂盒合成效率差异化的事实，相的总RNA用量、RT酶和RT时间，cDNA合成产量存在差异是完全可以预料的，这势必导致稀释后上样的cDNA输入量不同，再考虑到不同qPCR仪扩增性能不一致，不明确cDNA起始用量，实验结果的可重复性和稳定性就是空话。而现实情况是，大量刊文中都标明qPCR反应起始核酸模板用量的做法。

       其次是关于核酸品质紫外评估方法的问题。不仅A260/A230比值是否应该引入问题。对于Contamination assessment (DNA or RNA)与Purity (A260/A280)的内涵与联系，MIQE也欠一个说明的。从指南原文看，核酸污染评估指的是一种核酸（如RNA）中有另一种核酸(如基因组DNA)的少量残留污染，并且认为A260/A280比值(Purity测定指标)下降可认定RNA样品中存在DNA污染。如果Contamination assessment（E类）可用A260/A280比值变化（D类）来准确评估，那把二者分别划为E、D，本身自相矛盾。除非诸如从微量紫外可见光度计吸光度测定、琼脂糖凝胶电泳、荧光染料法、Agilent 2100 Bioanalyzer, Qiagen QIAxcel等中找到了比A260/A280比值更可靠、简便、经济的方法，否则，作为一个标准体系，Contamination assessment (DNA or RNA)的可执行性、严肃性难免要大打折扣。

        目前无论是综合应用类常规紫外可见分光光度计（如日立UH5300等），抑或生物学核酸蛋白测定用紫外可见光度计（如eppendorf BioPhotometer Plus、NanoDrop One系列、Implen NanoPhotometer N50及Nano 100/Nano 300等），系统预置的核酸测定工作协议中，A230、A260、A280、A260/A230A和260/A280指标早已用作行业标准。

       足见在核酸质量评价具体指标的问题上，MIQE指南这把宝刀的确有个豁口。

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