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如何用MIQE标准指导多重实时荧光定量PCR实验的流程与验证设计?-下
应用驱动型qPCR仪选型攻略-8
三、按MIQE要求建立多重实时荧光定量PCR分析法的实例分析
对多重实时荧光定量PCR方法分析性能的评价，MIQE指南设立了qPCR validation一环，实验者提供必要信息事项便于审核qPCR实验结果。其中E类（essential information）为必须随稿件提交的信息，而D类（Desirable information）属应尽可能提交信息项。
表2 MIQE checklist for qPCR validation
序号 | qPCR实验信息审查项 | 重要性 | qPCR反应信息项说明 |
1 | Specificity(gel, sequence, melt, or digest) | E | 实时荧光定量PCR法分析特异性指当样本中有其他非特异性靶标存在情况下，用qPCR法可针对性地检测到目标序列的能力。凝胶电泳/测序/熔解曲线等均可用于证明qPCR反应特异性。 多重实时荧光PCR反应的特异性还需交叉反应法验证。用于交叉反应验证的靶标有： 1）同源性核酸序列，或引起相同或相似症状的其他病原体核酸； 2）被检测基因的其他基因型片段或其他基因型构建的质粒等基因工程产品； 3）高浓度的其他核酸对目标核酸的交叉反应的验证。 |
2 | Calibration curves with slope and y-intercept | E | 建立实时荧光定量PCR实验的标准曲线目的在于评估目标片段扩增效率和依据标准曲线方程计算待测样品中目标片段模板初始含量，同时评估定量检测有效线性范围。 内参标准品可用载有靶基因线性化质粒DNA、比目的扩增片段长的纯化靶基因PCR产物或基因组DNA、浓缩的cDNA模板。须与靶基因同步扩增和具有相同扩增效率 1）用标准品和建立标准曲线对样本中靶序列绝对数量测定。 每个靶基因的绝对定量都需建立标准曲线。多重实时荧光定量PCR实验须为每种靶基因建立一标准曲线。 将含有已知靶序列拷贝数量的标准品，通过连续等比稀释（如1:2、1:3、1:10倍率稀释）制备至少5个浓度的标准品稀释液，每个稀释度设3个技术重复。标准品的靶基因拷贝数范围达到5-6个对数量级，足以覆盖待测样品的浓度区间，以确保定量准确性。 实时荧光定量PCR仪记录样本和标准品各稀释液的Cq值（每个反应管内的荧光信号到达设定荧光信号阈值时所扩增循环数），并以标准品稀释液中靶序列拷贝数的对数为x轴，该稀释度Cq值为y轴，生成标准曲线并给出线性拟合方程y=kx+b。将样品测试Cq值代入方程计算出样品的靶基因起始拷贝数。 2）相对定量多重实时荧光PCR实验，多个靶标可共同一个内参，建立一条内参标准品标准曲线和进行靶标的归一化处理。 |
3 | r2 of calibration curve | E | 实时荧光定量PCR仪软件生成标准曲线时自动给出曲线的回归相关系数R2值。它代表标准曲线回归线与标准反应的单个Cq数据点之间的拟合程度。R2值越接近1，说明曲线与测出数据吻合程度越高。 通常R2值>0.99被视为测试数据线性关系较理想。 |
4 | PCR efficiency calculated from slope | E | 使用标准曲线中回归线的斜率k来计算出扩增效率: PCR效率=10 -1/k -1 理论上k=-3.32，实际扩增时k值在-3.59～-3.10（对应于反应效率是90-110%）是较理想的状态。 |
5 | Linear dynamic range | E | 线性动态范围/标准曲线的定量范围 （PCR反应的动态范围，即平均校准曲线法的从最高到最低定量拷贝数。动态范围应跨越5-6个1og10浓度范围或至少达到3个数量级，以覆盖所检测目标的定量范围。 |
6 | Evidence for LOD | E | 单重qPCR的检测极限(Limit of Detection，LOD) 实时荧光定量PCR方法分析灵敏度可用检测极限表示。LOD是在特定分析程序在95%概率的下可以准确测定的样本中待测核酸模板的最低样本浓度（最小拷贝数）。当浓度在LOD水平处的待测样本进行多次重复测定，95%的概率可有效测定，而检测失败概率小于5%，则该浓度视为置信区间95%条件下的LOD。 标准曲线中b为y轴的截距，代表x轴上最低拷贝数的靶模板产生阳性扩增时的理论Cq值和检测方法的理论最低检测限（可能是3拷贝/PCR。假设符合泊松分布，PCR有95%的概率检测到1个拷贝）。 LOD常表述为单位质量的组织或单位体积的液体中模板的拷贝数(copies/μg或copies/μl)。 |
7 | Cq variation at LOD | E | LOD时的Cq变化 定量下限的界定时，应提供整个线性动态范围内的CIs值，报告线性范围内最低浓度处的变异。 |
8 | If multiplex, efficiency and LOD of each assay | E | 多重qPCR反应中每个分析目标的扩增效率和LOD 多重实时荧光定量PCR实验，多组引物-探针混合情况下，分别为每种测试靶标标准品建立标准曲线，评估在多重反应条件下每种靶标的扩增效率和测试LOD值。 |
9 | For SYBR Green I,Cq of the NTC | E | 阴性对照NTC的Cq（SYBR Green I适用） （在实时荧光定量PCR反应中，应设置无模板对照（NTC）孔，即含有水或缓冲液的反应孔但不含样本模板的反应孔。阴性对照反应孔中不应发生阳性的扩增信号） |
10 | Evidence of optimization (from gradients) | D | 多重实时荧光定量PCR反应条件最适的证明 常规多重PCR通常须分别进行单重PCR确定各引物和模板用量、退火温度和扩增循环数等扩增条件。据此进一步优化多重引物混合反应的扩增参数，确立多重PCR体系。特别是各组引物退火温度不一时，通过梯度温度实验来优化体系整体退火参数。 实时荧光PCR反应中，双温度循环法的退火-延伸参数固化，因此多重PCR中梯度温度优化，多重实时荧光定量PCR实验中不再作硬性要求。 但可提供多重PCR体系反应体积、各引物-探针组用量配比、循环次数和（或）退火温度优化方法和结果予以说明。 |
11 | CIs for PCR efficiency or SE | D | PCR效率的置信区间（confidence intervals，CIs）或标准误（standard error，SE） 平均PCR效率的CIs或SE值需对同一批样品采用相同操作流程和实验条件进行的多次校准曲线实验的方法得到，下同）。 |
12 | CIs throughout range | D | 整个检测范围的置信区间(CIs) （需对同一批样品进行多次重复标准曲线实验确认置信区间95%条件下样品浓度的检测范围） |
我们以德国霍恩海姆大学研究人员发表的《建立一种四重实时荧光定量PCR分析法鉴别大豆感染的真菌病原体D. longicolla，D. caulivora，D. eres和D. novem》为例，梳理多重实时荧光定量PCR分析方法的创建流程，使之符合MIQE指南要求。
3.1 实验研究背景
大豆茎溃疡病菌（Diaporthe）为间座壳属真菌，以菌丝形态寄生于种子、植株和土壤中。植株感染后发生茎杆腐烂而严重影响大豆产量，属各国禁止入境的检疫性有害生物物种。
全球食用非转基因大豆需求增长迅猛，加之气候变暖，中欧大豆种植扩大，加剧大豆茎溃疡病菌传播风险。植物病理专家确定D. longicolla（DPCL），D. caulivora（DPCC），D. eres（DPCE）和D. novem（DPCN）四种大豆茎溃疡病菌为该地区优势物种，尝试建立从种子、植株中快速可靠同时检测这4种病菌方法，用于豆种病原污染评估、筛选及开展大豆田间流行病学监测。
3.2 四重实时荧光定量PCR分析法建立步骤
表3 Step by Step of the establishment for quadruplex real-time PCR assay
Items | Steps | Materials and methods descriptions | Remarks |
| 1 | 多重实时荧光定量PCR目标确立 | 建立可同时鉴别DPCL、DPCC、DPCE和DPCN四种真菌的多重实时荧光定量PCR梵音检测体系 | |
2 | 引物（和）探针组设计和评估 | 基于TEF基因设计4种菌种特异性引物探针组： 1) sequence alignments：ClustalW as implemented in BioEdit (version 7.1.3.0); 2) Tm and potential secondary structures of primers and probes evaluated with Gene Runner (Version 6.5.52 Beta); 3) specificity of the primers evaluated by NCBI’s Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/); | 1）多重实时荧光PCR的正反向引物、荧光标记探针3个寡核苷酸均须是序列高度特异（如与其他序列结合会降低PCR效率、出现假阳性结果）； 2）BLAST软件序列特异性检查； 3）4重实时荧光PCR体系需鉴定12个寡核苷酸序列的特异性。 |
4种真菌TEF序列通用正、反向引物设计 （扩增4种病原菌的TEF基因片段） | 扩增产物既作荧光定量PCR引物探针特异性、灵敏度验证测试靶，又用作单重、多重定量PCR反应标准曲线内参标准品 | ||
大豆看家基因GmUKN2引物设计 （定量样品中大豆DNA数量） | 大豆DNA作为外参，计算单位质量的豆种中病原菌DNA量，评估真菌感染程度 | ||
| 3-1 | 待测和各种对照品DNA提取 | 4种培养的目标真菌菌丝基因组DNA的分别提取 | PCR产物制作定量内参标准品和实时荧光定量PCR检测目标 |
其他非目标病原菌DNA的分别提取 | 设立单独反应孔作对照，评估各引物-探针组的特异性 | ||
健康大豆植株中提取DNA | 作阴性对照设立单独反应孔，验证探针的特异性） | ||
人工DPCL菌属感染的大豆茎秆、种子和种皮中分别提取DNA | 用于实际检验四重荧光定量PCR检测方法的有效性 | ||
3-2 | 4种目标菌种TEF DNA序列PCR扩增 | Diaporthe isolates TEF regions amplifications TEF regions primers EF1-728F (5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’) and EF1-986R (5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’) in individual reactions for the different Diaporthe isolates. 25μl Reaction mixtures: 2.5μl 10x Taq buffer with (NH4)2SO4 (Thermo Fisher Scientific), 2.5μl 2 mM dNTPs, 2.5μl MgCl2 (25 mM), 12.5 pmol of each primer set, 1μl Taq DNA polymerase (1 U/μl), and 1μl genomic DNA. Amplification conditions: 3min - 95℃, 35 cycles (denaturation 30s -95℃, annealing 30s - 68℃, elongation 30s - 72℃), and a final 5min -72℃ elongation. PCR products were checked on 2% agarose gels electrophoresis. PCR products were purified using the PEQGOLD Cycle-Pure Kit (PEQLAB Biotechnologie) and determined by Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). PCR products containing 109 to 104 copies/μl, diluted with DNA prepared from soybean tissue, roughly 20ng, 2ng, 200pg, 20pg, 2pg, 0.2pg, and 0.02pg DNA per reaction. | 1）本例内参标准品用的是各目标菌属的TEF基因扩增片段； 2）文中实验结果中的标准品起始浓度范围为20ng – 0.02pg共7个数量级；实际配制了覆盖10-1010 copies共10个数量级的标准品。 |
3-3 | 4种目标真菌基因组DNA样品制备测定 | genomic DNA of the Diaporthe isolates was both determined by measuring absorption at 260nm and by Qubit 2.0. 1:10–1:106 dilution series were prepared with 50 μg/ml DNA prepared from healthy soybean tissue. | 1）各目标菌种DNA提取样品用健康大豆DNA稀释液稀释成1/10、1/100、1/1000三个浓度梯度（模拟真实检测样品基质条件测试），以降低DNA样品中PCR抑制成分干扰，确认实测条件。 2）目标菌株DNA样品用于评估多重实时荧光定量PCR体系引物-探针组的特异性。 |
4-1 | Assessing the specificity of the primer-probe sets | singleplex real-time PCR assays amplification efficiency Assessing: using serial dilutions of PCR products(10 to 109 copies) for amplification standard curves; Assessing conditions of the test for Diaporthe infestations, 1:1,1:10,1:100,1:1000 serial dilutions of genomic DNAs from the different Diaporthe isolates were also used for quantification standard curves; non-target Diaporthe species No-template controls were included 20μl Reaction mixtures:10μl ready to use SensiFAST Probe No-ROX mix (2x) (Bioline GmbH),8 pmol of each forward and reverse primers,2 pmol probe,2μl template DNA； Amplification conditions: 3 min at 95℃ and 40 cycles of 95℃ - 15s and 60℃ - 45s； CFX96 Real-Time PCR system (Bio-Rad) FrameStar 96-Well Skirted PCR Plates (4titude, USA) | DPCL、DPCC、DPCE和DPCN四引物-探针组扩增效率、特异性单重实时荧光定量反应验证 1）分别用四种菌株DNA、非目标菌株DNA及空白对照，逐一测试每各引物-探针组特异性； 2）以四TEF基因PCR产物作标准品分别建立单重荧光定量标准曲线，检验在避免PCR抑制干扰理想情况下单重反应的扩增效率和检测限； 3）用4种菌株DNA提取液的1:1、1:10、1:100、1:1000稀释液为内参标准品构建标准曲线，评价实测条件下的扩增效率和条件； |
4-2 | Assessing the specificity of the primer-probe sets | Duplex real-time PCR assays with primer-probe combinations （consists of 4 in individual reactions: parallel dilution series of both species，and one undiluted (20ng) genomic DNA combined with 1:1000 diluted genomic DNA of the other species） DPCL+DPCC DPCL+DPCE DPCL+DPCN DPCC+DPCE DPCC+DPCN DPCE+DPCN Reaction mixtures：10μl 2x SensiFAST Probe No-ROX mix, and a reduced amount of 4pmol of each primers set, 1 pmol of each of the two probes, and 2μl template DNA. Amplification conditions: as Duplex | 引物探针组特异性的交叉检验：将4个引物探针组两两配对（6种组合）进行双重荧光PCR实验。 1）对平行稀释DNA混合测试：分别对两种病原菌的未稀释(20ng)的DNA混合物、两种1/1000稀释DNA混合物检测； 2）对两种不同稀释度真菌DNA（一种1:1而另一种1/1000稀释）的混合测试，检验当一种模板浓度远高于另一个模板浓度情况下竞争抑制和多重反应有效性。如对DPCL+DPCC组合的测试分为： ①未稀释DPCL+稀释DPCC DNA混合； ②稀释DPCL+未稀释DPCC DNA混合； |
4-3 | Specificity of the quadruplex real-time PCR assay | 1）4种引物-探针组组合同时对2种真菌检测 DPCL + DPCC；DPCL + DPCE；DPCL + DPCN；DPCC + DPCE；DPCC + DPCN；DPCE + DPCN 2）4种引物-探针组组合同时对检测3种真菌检测 DPCL + DPCC + DPCE；DPCL + DPCC + DPCN；DPCL + DPCE + DPCN；DPCC + DPCE + DPCN 3）4种引物-探针组组合同时对4种真菌检测 DPCL + DPCC + DPCE + DPCN 4）4种引物-探针组组合对其他大豆病原菌种检测 Reaction mixtures：as Duplex Amplification conditions: as singleplex. | 四重实时荧光定量PCR检测体系特异性检验 1）4个引物探针组混合，测试2种、3种靶DNA共存时的特异性。 2）4个引物探针组能同时检测四种靶DNA的特异性。 3）所有情况下，各引物探针组均专一性扩增靶DNA。非目标菌体、健康大豆叶和茎的DNA测试均无扩增。 |
4-4 | 多重荧光定量PCR反应体系标准曲线的建立 | Standard curves establishing for the quadruplex real-time PCR assay DNA isolates from 4 target Diaporthe species were diluted with DNA prepared from soybean tissue, roughly 20ng, 2ng, 200pg, 20pg, 2pg, 0.2pg, and 0.02pg DNA per reaction； The standard curves used to calculate the amount of Diaporthe DNA in ng per reaction； a rough estimate of the limit of detection (LOD) and a Cq cut-off values. | 分别取4种菌株DNA，用健康大豆DNA连续稀释制备的内参标准品进行标准品标准曲线实验。 分别建立4个靶基因标准曲线； 确定各靶标检测的LOD（和Cq的cut-off值） |
5 | 多重荧光定量PCR反应方法的实测验证 | Validation of the quadruplex real-time PCR assay 1）Infected soybean stems detect DNA from Diaporthe spp. prepared from stem samples covered with pycnidia. D. longicolla DNA was detected in all tested samples with visible symptoms. For healthy stem samples the primer-probe sets produced no amplification. 2）Screening soybean seeds All four Diaporthe species could be detected in different seed samples known to contain seeds infected with Diaporthe strains. For healthy seeds no amplification. | 用实际感染目标真菌的大豆植株样品和大豆种子和健康大豆种对照，检验多重实时荧光定量PCR检测体系有效性。 |
6 | Reaction mixtures for quantifying soybean DNA | Reaction mixtures：10μl 2x SensiFAST SYBR No-ROX mix, 8 pmol each of primers GmUKN2f and GmUKN2r, and 2μl template DNA. as Duplex Amplification conditions: as singleplex. No-template controls were included | 用大豆GmUKN2基因作为外参，计算单位大豆中真菌基因含量，评估感染风险和鉴定豆种品质。 |
对照表3、4可以看出：MIQE指南中qPCR验证1-10个E类项，文中都悉数提供。D类项目的多重反应体系优化细节（如多重PCR引物-探针组组分间配比优化过程、循环次数优化、最终反应体积的优化和退火延伸温度选择等）、标准曲线实验的多次重复确认LOD依据、LOD检测限置信区间和LOD对应的Cq值SD均未见补充说明。此外，关于实验方法的Repeatability（E类）和Reproducibility（D类），文中也未提供说明。
相对而言，多重实时荧光定量PCR检测方法建立全流程，从单重反应到多重反应的建立、反应特异性验证及扩增效率评估方面，资料详实。
文中引入了多组引物-探针并存、高浓度非靶标竞争条件洗的检测特异性评估实验，在同类应用文献中少见，符合MIQE指南要求，尤其值得借鉴。
四、讨论
4. 1多重实时荧光定量PCR反应“重”数的问题
多重PCR反应是指在单个反应孔/管内用数组特异性引物同时扩增数个靶序列。“重”是指同一孔内被同时扩增的特异性序列的种数。单管内模板达到两种（双重PCR反应）即被视为多重反应。
多重PCR可以通过优化反应体系和反应条件提高扩增的片段种属。 理论上，只要PCR扩增条件合适，重PCR实验的模板重数可以不受限制。文献表明，受限于反应体系优化难度，常规科研实验以2-9重模板的反应多见。但多重PCR与毛细管电泳平台（如Beckman GenomeLab GeXP多基因遗传分析系统，Agilent 2100 Bioanalyzer等）结合，一次反应可对鱼类细胞生长调控、脂质代谢、糖皮质激素介导的信号通路、氧化应激和炎症等生理反应22个关键基因和3个对照基因的表达同时分析。而NGS测序的文库构建中，同步扩增模板可达数千重且上不封顶（high-multiplex PCR或ultrahigh-multiplex PCR和超多重PCR的提法纯属噱头，PubMed可查论文使用其概念者屈指可数）。
然而，多重实时荧光PCR反应中模板重数扩展则力不从心。
在多重实时荧光PCR反应中，每种扩增片段用正反向引物对+荧光标记探针组合标记，以便有效区分同一反应孔内的不同种靶序列的扩增信号。一色荧光占用一个检测通道。实时荧光定量PCR仪可同时使用荧光通道配置决定了单孔内可同时检测的靶序列“重”数。需指出，各品牌实时荧光定量PCR仪标称的检测通道数，并非完全等同于可同时检测的荧光颜色种数（见《实时荧光定量PCR仪荧光检测通道数量的内涵浅析》）。目前QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Pro、QuantiStudio 7 Flex和ViiA7等平台，基于荧光探针法的多重实时荧光PCR反应检测极限是6重。
将TOCE技术、多重PCR反应和HRM分析结合建立的Anyplex II RV16多重荧光PCR检测套装，突破6重限制，在单管中同时检测8种病毒基因。
无论荧光探针或HRM多重荧光定量PCR分析，对“重”的定义是一致的，即：须是在同一个反应孔(而非分散于多个孔）内同时扩增的靶标种数。
4.2 多重实时荧光定量PCR反应多少重为宜？
多重荧光定量PCR分析中，引物和探针设计特异性和有效性（不同靶点引物-探针要确保序列特异性，还需使引物Tm值差异可控以确保所有引物在同一个温度下退火延伸）、反应组份优化程度（各扩增片段数量、扩增效率不同，间存在抑制竞争效应。丰度高靶点扩增的先发数量优势，过多消耗dNTP和TaqDNA酶，会抑制较低丰度靶点扩增）是扩增效率的主要限制因素。
此外，特异性验证流程有BLAST序列特异性检查、单重反应验证、多重交叉验证、高浓度竞争抑制验证等4个环节。分析靶标种数增多，引物和探针设计难度加大，两两组合交叉验证工作量随之剧增。
相对而言，3重实时定量反应，验证环节实验量较4重反应减少1/3。就效费比，3重定量PCR方法要优于4重反应。
设计5-6重实时荧光PCR实验，首先是设计和性能验证更复杂繁琐。其次，实时荧光定量PCR仪所配检测通道要能支持6色荧光同时检测。因部分机型检测通道的信号采集时间不同步，首末两个通道检测的靶标在信号采集时退火-延伸反应时间不对称。靶标种数越多，2个通道信号采集点时差越长，不同通道对应靶标退火进程有别，必会影响靶标数据检测准确性和信号强弱对比（见《实时荧光定量PCR仪检测通道数量扩充的革命来啦？》）。
因此科研应用中，多重实时荧光定量PCR反应的模板重数应量力而行。
4.3 多重实时荧光定量PCR实验规范化问题
在引物和探针商业化定制服务便利化、实时荧光PCR反应95℃-60℃双温度循环扩增盛行的背景下，实施多重实时荧光定量PCR，依然面临反应体系组分配比优化（可参考《Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach》、《Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol》等经典文献）和多重实时荧光检测方法验证的难点。
临床诊断、检验检疫和生物医学科研实验，对定量PCR方法的准确性、敏感性、特异性、线性范围CIs、LOD/LOB/LOQ、Cq的CV值等分析性能要素不尽相同。因此，MIQE指南把退火温度优化、PCR效率及线性检测范围置信区间信息项列为D级，不作强制要求。
调研表明，越是在高分期刊的发文，在按MIQE指南要求设计和验证多重实时定量反应方法方面疏忽的现象越严重。特别是多重实时荧光反应多引物-探针组、多模板并存情况下反应特异性的交叉验证欠缺普遍。当不同模板浓度相差悬殊条件下是否存在PCR竞争抑制的问题，几乎被大多数实验者忽视。
此外，验证多重实时PCR反应方法的可重复性、结果再现能力、PCR效率和LOD线性区间等问题，业内尚未达成一致。
参考文献
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