如何用MIQE标准指导多重实时荧光定量PCR实验的流程与验证设计?-上

应用驱动型qPCR仪选型攻略-8 

       普通PCR实验是每个反应孔中用一组特异性引物对一种靶基因片段的扩增，为单靶标或单重PCR反应（singleplex PCR/uniplex PCR/Monoplex PCR）。多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction/Multiplex PCR，mPCR）是指每个 PCR 反应孔中混合使用两组或多组不同引物，在单一PCR反应中同时对多个DNA模板（Multiple Template PCR Reaction）或同一长DNA序列模板的不同区域（Single Template PCR Reaction）扩增的PCR反应。1988年，美国分子遗传学家首创多重PCR方法，应用于产前、产后的杜氏肌肉营养不良症（DMD）筛查诊断，在一个反应孔中用6组引物对抗肌萎缩蛋白基因的6个易缺失外显子片段进行扩增。 

       将多重PCR技术作为内核，与凝胶电泳或毛细管电泳分析结合，构成完整多重PCR分析（Multiplex PCR Assay）流程，可用于感染性疾病的筛查与鉴别诊断、遗传疾病诊断、细菌耐药基因检测、物种鉴定分型、基因克隆筛选、基因突变与缺失检测、基因分型、基因修复和基因转录调控机制等研究。 

       把多重PCR反应作为基础步骤，整合进NGS测序、染色体免疫共沉淀多重PCR分析（ChIP-mPCR）、多重连接探针扩增技术(Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)、滚环DNA扩增技术( rolling circle DNA amplification, RCA) 、SNP panel identification assay (SPIA)，多重串联PCR（Multiplex Tandem PCR/MT-PCR)、多重PCR /液相色谱联用分析法(multiplex PCR/liquid chromatography assay，MP/LC)等检测流程，早已在基因文库制备、多位点STR、SNP基因突变分析等研究中得到应用。 

       而多重PCR与实时荧光定量PCR相结合，使多重实时荧光PCR分析技术（multiplex real-time PCR assay）破茧而出。

一、多重实时荧光PCR与多重PCR概念不同

       PubMed检索数据显示，2016.01-2021-11期间，标题中含multiplex PCR的实验文章共311篇，包括Nat Protocol（IF13.491，1篇）、Acta Pharm Sin B（IF11.413，1篇）、Crit Care（IF9.094，3篇）、Clin Microbiol Infect（IF19.074，2篇）、EBioMedicine（IF8.143，1篇）、Microbiol Spectr（IF7.172，2篇）。仅4篇文章标题用multiplex PCR但实际用的是实时荧光定量PCR方法（Biofire FilmArray Multiplex PCR、Anyplex II RV16、Multicolor melting curve analysis和Color-coded molecular beacons）法。

       以multiplex PCR[Body - Key Terms] AND "Nucleic Acids Res"[Journal]检索获得多重PCR实验文章共61篇。其中6篇用的是多重实时荧光定量PCR分析法，在“材料和方法”中标明为quantitative reverse transcriptase multiplex PCR、quantitative multiplex PCR、Real-time multiplex assays、Multiplex quantitative PCR、Quantitative real-time multiplex fluorogenic PCR及multiplex real-time PCR。仅1篇文中使用“For multiplex PCR 200 nM of each primer (HT17, NR24 and BAT26) was added”表述，而附表1: “List of primers used”显示，实验是FAM荧光标记引物加溶解曲线分析的实时荧光PCR方法。

       这表明，超过98%的研究人员对multiplex PCR和multiplex real-time PCR在概念上是有严格区别的。多重实时荧光定量PCR分析法用的是quantitative multiplex PCR、multiplex real-time PCR assay类似表述，而非常规多重PCR的multiplex PCR assay或mPCR。 

二、多重实时荧光定量PCR分析的应用优势

       在多重PCR中，通过在反应中包含一对以上的引物，可以扩增出多个目标序列。多重PCR有潜力在实验室内节省大量的时间和精力，而不影响检测效用。多重实时荧光PCR分析融合了多重PCR和实时荧光定量PCR两种技术方法的天然优势发展起来的，具有快速高效、特异性强、灵敏度高的特点。 

1. 内部参照（Internal Control，IC）优势

       常规单重实时荧光定量PCR实验中设有单独的内参反应孔，一是检验扩增条件的可行性（评估PCR扩增条件和实验设置有效性、扩增效率、PCR反应抑制程度和PCR反应假阴性鉴别等），二是用于对各样品检测数据的归一化（消除不同反应孔初始样本量、样品准备过程差异对结果的影响）。

        在多重实时荧光PCR分析中，多个模板是在同一个反应孔中、在相同条件下平行扩增，每个扩增子为其他扩增子提供了一个内部对照，便于鉴别潜在的PCR反应失败引起的假阴性问题。

        在基因缺失的多重PCR检测中，多个外显子被扩增。除非被扫描的整个区域缺失，否则只要有部分片段的得以成功扩增，就足以表明扩增反应没有问题。所检测到的DNA片段缺失是真实的遗传性缺失而非检测技术的局限、错误等导致的假缺失。  

2. 高效率低耗费优势

       用相同样品、相同反应体积时，单一模板的多重实时荧光PCR反应，只需提取一次核酸。一个反应孔相当于完成了常规单重PCR数孔的检测任务，样品与试剂消耗、PCR体系构建准备工作量与时间投入都显著减少。

       当临床样本难以收集或所获的样品体积受限（如中枢神经系统疾病采集的脊髓液、孕妇羊水标本等），或当多个可导致同一临床表现的不同病原体感染疾病的筛查，单次采样检测多个致病靶点，可在短短2-3小时内实现疾病快速、精准诊断，有利于及时启动针对性治疗和传染性疾病的防控措施。

       双重实时荧光定量PCR反应是在同一反应孔同时扩增靶序列和内参，较常规两种序列分开在两个单独孔中进行单重反应，反应板样品通量提高2倍。同时，每个反应孔都减少一半样本和试剂用量。若将两个检测靶标与一个内参组合进行三重实时荧光定量反应，则样本用量和试剂用量将进一步降低。 

3. 反应模板质量的可靠指示能力（Indication of Template Quality）

       PCR反应的理论效率为100%，表示在指数扩增阶段每次热循环后的扩增产物数量翻倍。但扩增片段的长度、GC含量、反应中各组分的浓度以及聚合酶品质等诸多因素影响，导致实际PCR反应效率低于 90%。

       因生物样品本身就可能含有抑制逆转录和PCR反应的多种成分，如动物肌肉中的肌红蛋白、尿素，植物组织中的多糖多酚等。多种常用的核酸提取纯化试剂，如苯酚、氯仿、SDS等能抑制Taq酶的活性。抑制剂残留过多的低纯度反应模板，会抑制PCR反应，使得扩增效率超过 110%。通常，抑制剂在高浓度模板中的浓度高，PCR抑制作用强；模板稀释后抑制剂浓度下降，抑制作用随之减弱。

       因此，当扩增效率＞110%或＜90%，说明PCR效率存在异常。

       此外，反应模板如有降解，则引物无法有效退火步骤稳定与目标区域结合，也会造成扩增效率下降。因此，高品质的反应模板是确保实时荧光定量PCR反应效率、检测灵敏度、定量准确性和定量检测线性范围的基本要求。

       多重PCR反应比单重PCR反应能更有效地反映模板质量。

       在多重反应中，模板发生降解后，会出现长片段的扩增信号比较短目标序列信号弱的征象。此外，PCR抑制剂导致的扩增效率降低通过高丰度对照序列扩增损失和参考标准曲线实验中丰度极低靶序列的扩增效果予以判别。 

4. 模板定量的精度优势

       多重实时荧光定量PCR实验须将检测目标序列扩增数据用内参对照测试值做归一化处理和分析。

       PCR反应体系准备过程中移液精度波动、仪器热循环模块反应孔间温度均一性和模块温控精度误差等客观因素制约，即便同一个样品分散在多个不同反应孔中进行单重PCR扩增时，triplicate或quadruplicate技术重复的孔间检测数据往往也不一致。同理，将待测靶点与内参分开各自独立扩增取得的初始数据归一化结果，与二者合并执行多重PCR反应的标准化数据，存在差异是毋庸置疑。而且数据差异程度会因操作误差和仪器温控性能区别而异。

       目标序列和内参合并执行多重实时荧光定量PCR反应的优势显而易见。由于同一反应孔中的靶点和内参数据源于一次加样，PCR体系构建中加样操作误差对靶标和内参的影响均衡化。用同一反应孔的内参对靶点标准化所得数据，比利用单重PCR反应获得的结果，误差小，精度理应更高。 

对于高精度定量实验，如拷贝数变异（copy number variation ,CNV）分析实验，模板拷贝数具有2倍差异时，7300、7500实时荧光定量PCR仪检测精度就够。但区分1.5倍的拷贝数差异，就需用QuatiStudio 3、QuatiStudio 5、QuatiStudio 6 pro和ViiA7这类有更高分辨精度的荧光定量平台。而多重实时定量PCR分析更有利于达到所这类实验所需的辨别精度。

       多重实时荧光定量 PCR实验技术以来，在基因缺失分析、突变和多态性分析、表达分析和RNA检测等应用方兴未艾。上至Nature、Lancet、Mol Cancer、Neuron、Nucleic Acids Res、Nat Commun、Eur J Hum Genet、J Exp Med、PANS，下至J Clin Microbiol、PLoS One、Am J Pathol、J Mol Diagn等，刊发的Multiplex Quantitative Real-Time PCR assays实验论文浩如烟海。

表1 multiplex real-time PCR assay应用实例举隅

 （未完待续）