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如何让SYBR Green实时荧光定量PCR实验MIQE起来？
应用驱动型qPCR仪选型攻略-7
SYBR Green I是科研qPCR实验普遍使用的荧光染料。由于SYBR Green I可与包括PCR反应非特异性产物在内的所有dsDNA结合，故须在扩增结束后增加熔解曲线分析（Melting Curve analysis）以鉴别qPCR产物特异性，来验证定量实验结果。Tm接近的产物对熔解曲线分辨力要求极高，而实时荧光定量PCR仪的控温性能和荧光染料属性的不同无疑使得鉴别效力有别。有种说法是，用SYBR Green I做的qPCR实验结果很难被牛刊编审认可。若实情如此，那melting curve analysis岂不白做？
对TaqMan荧光探针法qPCR实验，MIQE指南要求提供实验标准曲线方程信息、PCR扩增效率、检测极限(LOD)以及检测动态线性范围。对Multiplex real-time PCR，须注明每种靶标的扩增效率和LOD值。
而SYBR Green I染料法qPCR实验，指南规定：要有实验阴性对照的Ct值，凝胶电泳、DNA测序、熔解曲线、扩增片段大小或DNA限制性内切酶酶切实验来进一步检验PCR产物特异性［specificity must be validated empirically with direct experimental evidence (electrophoresis gel, melting profile, DNA sequencing, amplicon size, and/or restriction enzyme digestion)］。这里restriction enzyme digestion用“and/or”的表述，说明是可选项；而electrophoresis gel, melting profile, DNA sequencing, amplicon size则是必选动作。
那实际发文中，人们是如何贯彻MIQE指南的这个验证政策的？
一、高分期刊论文中qPCR实验SYBR Green I的使用现状抽样调查
我们选择了用Viia7实时荧光定量PCR仪和SYBR Green I染料法，且实验结果发表在IF15以上期刊的实验案例进行了调研。
以［ViiA7[Text Word] AND PCR[Text Word] AND("0001/01/01"[PubDate] : "2021/09/30"[PubDate])］为检索条件到3201条论文。筛选IF≥15期刊发文，对文章的正文、Supplementary Material相结合确认后，从入选37种期刊（包括了Nat Biotechnol、Nat Med、Nature、J Clin Oncol、Cell、Cancer Discov、Nat Genet、Cancer Cell、Immunity等IF30分以上刊物）中，获得176篇article。内容涉及细胞生物学、免疫学、遗传学、分子生物学、临床医学、微生物学等。再依据qPCR实验用SYBR Green I、TaqMan探针法对文章分类计数。
表1 IF15以上期刊发表的基于Viia7系统进行的qPCR实验论文列表（2021-09-30）
期刊 | 2021年IF | SYBR Green | TaqMan | Viia7 | 年份 |
Nat Biotechnol | 54.901 | 1 | 1 | 2 | 2015-2020 |
Nat Med | 53.443 | 5 | 7 | 10 | 2012-2020 |
Nature | 49.963 | 13 | 8 | 20 | 2013-2019 |
J Clin Oncol | 44.541 | 0 | 1 | 1 | 2016 |
Cell | 41.584 | 7 | 3 | 8 | 2016-2021 |
Cancer Discov | 39.392 | 2 | 5 | 7 | 2012-2019 |
Nat Genet | 38.333 | 2 | 3 | 4 | 2012-2019 |
Cancer Cell | 31.741 | 7 | 5 | 10 | 2013-2019 |
Immunity | 31.741 | 3 | 2 | 5 | 2017-2020 |
Circulation | 29.692 | 2 | 1 | 2 | 2017-2018 |
Nat Cell Biol | 28.824 | 2 | 4 | 4 | 2015-2020 |
Nat Methods | 28.541 | 2 | 0 | 2 | 2015-2019 |
Mol Cancer | 27.402 | 0 | 2 | 2 | 2014-2016 |
Cell Metab | 27.283 | 1 | 3 | 3 | 2017-2020 |
Cell Res | 25.611 | 3 | 0 | 3 | 2013-2019 |
Nat Immunol | 25.602 | 5 | 4 | 8 | 2012-2021 |
J Hepatol | 25.083 | 1 | 1 | 2 | 2016 |
Nat Neurosci | 24.881 | 3 | 0 | 3 | 2017-2019 |
Cell Stem Cell | 24.633 | 8 | 4 | 11 | 2017-2020 |
Blood | 22.111 | 6 | 1 | 6 | 2014- 2018 |
Alzheimers Dement | 21.562 | 0 | 2 | 2 | 2015-2018 |
Am J Respir Crit Care Med | 21.404 | 0 | 1 | 1 | 2014 |
Cell Host Microbe | 21.022 | 0 | 2 | 2 | 2016-2017 |
Ann Rheum Dis | 19.101 | 2 | 2 | 2 | 2016 |
Signal Transduct Target Ther | 18.184 | 1 | 0 | 1 | 2021 |
Mol Cell | 17.972 | 5 | 1 | 6 | 2015-2020 |
Sci Transl Med | 17.951 | 4 | 4 | 2015-2021 | |
Nat Microbiol | 17.742 | 3 | 0 | 3 | 2017-2018 |
Sci Immunol | 17.721 | 1 | 2 | 3 | 2017-2020 |
Nucleic Acids Res | 16.973 | 12 | 5 | 17 | 2013-2021 |
Adv Sci (Weinh) | 16.801 | 1 | 1 | 1 | 2013-2019 |
Mol Biol evol | 16.242 | 0 | 1 | 1 | 2014 |
Mol Psychiatry | 15.992 | 1 | 2 | 3 | 2018-2021 |
ACS Nano | 15.883 | 0 | 1 | 1 | 2021 |
Cell Death Differ | 15.823 | 8 | 7 | 13 | 2013-2020 |
eur J Heart Fail | 15.533 | 0 | 1 | 1 | 2021 |
Nat Struct Mol Biol | 15.364 | 2 | 0 | 2 | 2014-2019 |
小计 | 113 | 83 | 176 |
结果显示：
1.1 使用SYBR Green染料法与Taqman探针的qPCR实验文章数量分别为113篇（64.20%） 和83篇（47.16%），其中17.04%的实验同时采用了两种方法；
1.2 包括Nat Biotechnol、Nat Med、Nature、J Clin Oncol、Cell、Cancer Discov、Nat Genet、Cancer Cell、Immunity在内的众多顶级影响力期刊，对使用SYBR Green I染料标记法，未显示歧视迹象；
1.3 对176个实验应用的“聚类”分析显示，涉及基因表达相对定量分析、基因敲除/基因沉默验证、基因绝对数量分析、基因分型鉴定、免疫共沉淀-定量PCR分析、miRNA调控功能分析、基因编辑与修饰水平分析、DNA损失修复机制和DNA去甲基化检测等共10个类型。排除Multiplex多重定量PCR、SNP基因分型和临床样品病毒载量检测，SYBR Green渗透入其他全部应用类型。
表2 基于ViiA7系统开展实验应用分类表
应用类型 | 发文数量 | |
SYBR Green Assay | Taqman Assay | |
Relative gene expression analysis (RQ) (基因表达相对定量分析) | 55 | 42 |
RNAi基因沉默 (siRNA/microRNA/lnc RNA/shRNA)、敲除验证 | 37 | 14 |
absolute copy number (AQ) (基因表达绝对定量分析) | 7 | 9 |
Gene Genotyping (基因分型鉴定) | 0 | 6 |
ChIP-qPCR assay (免疫共沉淀-定量PCR分析) | 7 | 0 |
microRNA assays (miRNA调控功能分析) | 2 | 3 |
Gene modification levels (基因编辑水平分析) | 2 | 1 |
DNA损伤修复机制 | 2 | 0 |
DNA去甲基化无亚硫酸氢盐检测 | 1 | 0 |
这113个用SYBR Green I染料法进行的qPCR实验中：
针对所用引物序列提供了qPCR扩增运行协议详细参数者，仅7篇；
明确注明所用染料的制造商、货号者仅一例；
明确标注实验所用仪器制造商、型号及反应模块信息者3例。
表3 quantitative PCR assay with melting curves analysis
Reportor dye | Thermal cycling parameters | qPCR instrument | Source of the data |
PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher #A25742) | denaturation step 40 cycles; melting curves | ViiA7 | Daniel A. Skelly, et al. Cell Stem Cell. 2020;27(3): 459–469.e8. |
Power SYBR Green PCR Kit(Thermo Fisher) | Thermal cycling; melting curves; PCR products were separated on a 1.5% agarose gel | ViiA7 | Jong Jin Jeong, et al. Cancer Discov. 2019;9(6): 778–795. |
power SYBR green PCR mastermix(Thermo Fisher) | 50℃ - 2 min → 95℃ - 2 min; 40 cycles:95℃ - 15s → 60℃ - 1 min; melt curve analysis; sequencing the amplicons | ViiA7 or Quantstudio 5 | Smita Kulkarni, et al. Nat Immunol. 2019;20(7): 824–834 |
SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher) | 50℃ - 5 min → 95℃ - 10 min; 40 cycles:95℃ - 15s → 60℃ - 1 min; Dissociation curves (60℃- 95℃) | ViiA7 / 384-well | Chi-Fan Yang, et al. Am J Hum Genet. 2018;102(2): 219–232 |
Power SYBR Green PCR Master Mix(Thermo Fisher) | 95℃ - 10 min; 40 cycles:95℃ - 15s → 60℃ - 60s; melting analysis | ViiA7 | Mariko Kuroda, et al. J Clin Invest. 2017;127(9): 3496–3509 |
Power SYBR Green mix(Thermo Fisher) | 50℃ - 2min → 95℃ - 10min; 40 cycles:95℃ - 15s → 60℃ - 1min; melting curve analysis; Sanger sequencing. | ViiA7 | Britta Will, et al. Nat Med. 2015;21(10): 1172–1181 |
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | 95℃ - 3min; 40 cycles:95℃ - 15s → 15s - 60℃ → 15s - 72℃; a melting curves | ViiA7 /384-well (Agilent Bravo Automate Liquid Handling Platform) | OcéaneC. B. Martin, et al. Microbiome. 2019;7: 72 |
PerfeCta SYBR green FastMix, Low ROX (Quanta Biosciences) | denaturation step:95℃ - 3min; 40 cycles:10s - 95℃ → 30s - 60℃; melting curves | ViiA7 /384-well | J Cui, W J Placzek Cell Death Differ. 2016;23(10): 1681–1690 |
SYBR Master mix | melting curves | ViiA7 | Matteo Vecellio, et al. Ann Rheum Dis. 2016;75(8): 1534–1540 |
SYBR FAST Universal 2×qPCR master mix (Kapa Biosystems) | 95℃ - 3 min; 40 cycles:94℃ - 20s → 50℃ - 30s → 72℃ - 30s; melting curves (65–95℃) | - | Phillip L. Molyneaux, et al. Am J Respir Crit Care Med. 2014;190(8): 906–913 |
对表3全部10篇文章的熔解曲线分析步骤所用染料类型及厂商信息确认结果表明，全部染料属常规非饱和型SYBR Green I染料。
其中，Jong Jin Jeong等人用琼脂糖凝胶电泳+熔解曲线分析两种方法证明PCR产物的特异性。
而Britta Will等则采用熔解曲线分析和扩增子测序的验证方法。虽仍不完全满足MIQE指南的要求，但毋庸置疑，这个验证流程的可信度最高。
二、HRM在qPCR中应用的特点和技术要求
DNA双链长度一致的情况下，碱基互补的双链热稳定性通常要高于碱基错配双链。熔解曲线分析法是利用不同DNA双链固有的Tm特征，通过均匀升高样品温度，使热稳定性不同DNA由双链依次熔解成为单链。而只能结合dsDNA的SYBR Green I在dsDNA解链后，从局部解链的DNA 分子上脱落，发射荧光信号强度随之剧减。故通过实时检测升温过程荧光信号的变化，可对PCR产物中不同DNA组份进行区分。
高分辨率熔解曲线分析（High Resolution Melt，HRM）技术源于熔解曲线分析，所不同的是它需依托高分辨率熔解温度控制装置和饱和性DNA荧光染料的支持。
2.1 HRM分析用的饱和荧光染料
饱和荧光染料与DNA结合的特性不同非饱和荧光染料（最常用的是SYBR GreenⅠ）。高浓度SYBR GreenⅠ会抑制PCR 反应，故在荧光定量实验中所用浓度很低，无法达到使DNA 双螺旋小沟全部饱和结合的程度。最关键的是，DNA解链过程中，染料在从已解开的呈单链状态部分片段上脱落的同时会转到临近的、尚未解链的双链残部并与之结合（结合部位重排）而继续发射荧光。DNA双链已开始熔解，但样品荧光强度却短暂地维持不变，监测的溶解曲线无法实时准确反应DNA解链状态，对温度分辨率降低。
常用的饱和荧光染料有evaGreen、LC Green/LC Green Plus、SYTO 9、ResoLight等。饱和荧光染料（PCR抑制作用极其微弱可以忽略）可在DNA双链中所有可结合位点分布，与DNA的结合呈饱和状态。在双链熔解过程中，尚未解链的双链残部已因无染料可结合位点，染料无法转移重排而从DNA双链上解离，染料荧光强度立即消失。故饱和染料溶解曲线分析荧光信号变化可以实时、准确反映DNA双链随着温度解链情况，据此有效区分DNA片段碱基组成的细微差异。具有高灵敏、高分辨率的特点和善于鉴定纯合型序列突变的巨大优势。
2.2 HRM分析所需硬件支持
计算表明，单核苷酸多态性（SNP）的纯合野生型（homozygous wild-type）、纯合突变型（homozygous mutant）扩增子间Tm存在0.0~1.3℃不等差异。单个SNP的异源双链DNA（heteroduplex）比最稳定型同源双链DNA（homoduplex）的Tm低1.1-3.0℃。单碱基复合杂合突变序列（compound heterozygotes），与纯合野生型序列Tm差异不过2.8–4.0℃。
表4 Human SNP Occurrence and Tm
SNP Class | Base Change | Typical Tm Curve Shift | Occurrence |
1 | C/T & G/A | Large(>0.5℃, average 1.0℃) | 64% |
2 | C/A & G/T | Large(>0.5℃, average 1.0℃) | 20% |
3 | C/G | Small(0.2–0.5℃) | 9% |
4 | A/T | Very small(<0.2℃) | 7% |
跨越Tm温差范围所需时间相对于2.2-3℃的PCR变温速度太过短暂（最低可设定为0.050℃/s）。但早期的ABI 7700、LightCycler 1.2/2.0等实时荧光定量PCR仪的CCD数据采样间隔高达数秒（见《实时荧光定量PCR仪检测通道数量扩充的革命来啦？》），无法实现溶解曲线荧光信号实时采集，更遑论用于HRM分析。
在HRM技术初创时，PCR产物先以20℃/s速率被加热到90℃，接着以相同速度冷却到40℃以充分形成各种异源二聚体。再用高分辨率熔解曲线仪将样品温度以0.3℃/s的标准速率均匀升高，同时以不低于10次/℃的采样密度监测65℃ -95℃范围荧光信号变化。市面HRM分析仪CCD采样频率高达100-200次/秒。
可见，若同时进行96个样品HRM分析，则qPCR热循环模块温控精确性（≤0.3℃）、均一性（≤±0.3℃），软件需自动调整CCD荧光数据采集频率，以适应曲线熔解步骤数据检测要求。
早期的实时荧光定量PCR仪，控温精度近±0.4℃，孔间温差高达±0.4-0.5℃，用于Tm差异2℃以上非特异性二聚体鉴别尚可，无法胜任复杂SNP检测。
目前，包括赛默飞ViiA7、QuantStudio 1、QuantStudio 3/5、QuantStudio 6 /7 Pro、StepOne / StepOnePlus、7500 Fastreal-time PCR system，伯乐CFX96/384、CFX96/384-touch及CFX Opus 96/384real time PCR Detection system在内多款实时荧光定量 PCR仪，可用饱和型荧光染料和HRM软件实现HRM分析功能。
LightCycler 480II是采用SimplProbe探针进行SNP分型鉴定。
三、关于SYBR Green染料法在qPCR实验中应用的思考
3.1 SYBR Green I单峰势单力薄
SYBR Green I最早仅限用于Tm相差超过2℃ PCR扩增片段的鉴别。
对在囊性纤维化基因I507/F508区域扩增产物的熔融曲线实验也证实，相同片段，SYBR Green I测得的Tm值比采用5 –荧光标记引物对照组高2℃。对长度41-44 bp的杂合样本的熔解曲线分析结果显示，5 –荧光标记引物组图出现了与预期一致的两个同源双链产物+两个异源双链产物峰。而SYBR Green I标记组每个基因型只有一个同源双链产物峰。
说明，不同基因型扩增产物Tm差异减小会使SYBR Green I分辨力丧失，产物特异性验证失效。凭SYBR Green I染料熔解曲线单峰表现，断言qPCR扩增的特异性显然不够。
3.2 HRM高分辩曲线亦须审慎
基因组水平上单碱基突变引起的DNA 序列多态性，有同型碱基之间（G-A或T-C）的转换、嘌呤与嘧啶(A-T、A-C、C-G、G-T) 之间的颠换、单个碱基插入和碱基缺失4大类型。颠换纯合突变片段Tm值存在0.8～1.4℃的差异。但转换纯合突变片段间的Tm值区别极其细微（通常＜±0.4℃），甚至qPCR仪用HRM分析难以分辨。
此外，随着扩增片段长度增加，HRM检测灵敏度和特异性降低。对于仅1-2 bp碱基差异大片段分型时，HRM技术分辨率是不够的。
对复杂遗传背景扩增产物特异性验证的可信性，HRM技术与TaqMan荧光探针是有差距的，不可同日而语。
3.3 MIQE指南所言入木三分
正因为SYBR Green I荧光染料标记技术的固有缺陷，业内对其在qPCR实验的应用保持谨慎的态度。MIQE指南在引物和探针序列经BLAST分析验证、扩增结束引入熔解曲线分析基础上，要求对qPCR产物特异性引入凝胶电泳甚至基因测序实验确认。但时至今日，学界对MIQE指南规定的qPCR实验结果验证的技术方法意见依然不统一。
SYBR Green I、LC Green、evaGreen、SYTO 9等荧光染料标记法对于qPCR实验，当用尽用，毫无疑问。
熔解曲线或HRM分析之外增加PCR产物凝胶电泳条带专一的验证，确是MIQE力挺的。虽有可能招来“没必要”这类善意“中评”，但应祝贺！因为实验者对qPCR验证的思想境界显然已对标Cancer Discov刊文作者啦！
参考文献
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［3］Cameron N. Gundry, Joshua G. Vandersteen, Gudrun H. Reed, et al. Amplicon Melting Analysis with Labeled Primers:A Closed-Tube Method for Differentiating Homozygotes and Heterozygotes. Clinical Chemistry，2003；49(3):396–406
［4］Luis B. Barreiro, Ricardo Henriques, Musa M. Mhlanga. High-Throughput SNP Genotyping: Combining Tag SNPs and Molecular Beacons. Single Nucleotide Polymorphisms. 2009; 578: 255–276.
［5］ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User´s Manual(904989B,01/2001)
［6］Robert Graham, Michael Liew, Cindy Meadows,et al. Distinguishing Different DNA Heterozygotes by High-Resolution Melting.Clin Chem. 2005;51(7):1295-8
［7］A Guide to High Resolution Melting (HRM) Analysis（Thermo Fisher）
