实时荧光定量PCR仪检测通道数量扩充的革命来啦？

应用驱动型qPCR仪选型攻略-6

       伯乐MyiQ实时PCR仪配有一FAM/SYBR Green I荧光检测通道，具备基因表达、基因拷贝数、阴阳判定等基础分析功能。 

       Eppendorf Mastercycler ep realplex 2和伯乐DNA Engine Option 2代表的FAM/SYBR Green I和HEX/TET/VIC双通道荧光检测系统，可在一个反应孔中同时检测两种荧光信号，使基因表达双重PCR检测(Duplex)、复杂SNP基因分型实验成为可能。但2个通道实时荧光PCR仪，不能检测620nm波长信号，无法使用TaqMan Universal PCR Master Mix这类含ROX参比荧光染料的试剂，限制了进行更复杂Multiplex定量分析或诸如LC Red 640一类染料标记TaqMan探针检测。于是，3通道的QuantiStudio 1和Stepone，4通道的QuantiStudio 3、SteponePlus和Stratagene Mx3000P、5通道的7500 Fast、QuantiStudio 6 Pro和CFX Opus 384等）和6通道的QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Flex、CFX96-Touch和CFX Opus 96等多检测通道qPCR仪应运而生。不仅方便了Triplex、quadraplex、five-target甚至six-target这类多靶标同步定量分析，还为系统兼容FRET双杂交探针应用提供了关键硬件支持。 

       2008年，LightCycler 480 II首开6个荧光检测通道记录，伯乐CFX 96、ABI Viia7于2010年前后脚尾随而至。竞争驱动下，实时荧光定量PCR仪新一轮扩充荧光通道数量的革命快要来了吗？

一、qPCR仪荧光信号采集流程的分析 

       实时荧光数据采集（Data Collection or Plate Read）时间点因实验类型而有区别。对于定量分析实验，无论是SYBR Green I染料，还是荧光染料标水解探针、FRET双杂交探针，通常是在PCR延伸步骤进行数据收集。 

       PCR退火温度是指体系中50%引物处于与模板结合状态时的温度。这一常识告诉我们，反应孔内引物、探针与模板片段的特异性结合并非顷刻间同步完成的，而是有一个持续数秒钟时间的过程。故荧光数据采集是个动态过程，系统自动生成多个时间点，最终将多个时间点采集数据均值代表本循环荧光数据并存储。 

       安捷伦Mx3000P qPCR系统中，用户通过软件的“高级算法设置”选项可对每个循环中荧光数据采样次数设置（设定范围1-31，默认为3次）。系统自动计算完成指定数量采样所需的总读板时间、决定每一论循环的首个数据采集启动时间。如，间隔7秒钟采样一次，每个循环收集数据3次，则系统将在每一循环的延伸步骤倒数第21秒这个时间点启动荧光数据采集（For example, if reading a plate takes 7 seconds and the specified number of data collection points is 3, the system will begin collecting data when 21 seconds remain in the plateau or ramp.）。如延伸步骤时间设定低于21秒，系统将提示时间设置无效。 

       默认情况下，ABI PRISM 7700 Sequence Detection System每隔7秒中在PCR循环的延伸阶段进行一次荧光信号采集。CCD每次曝光持续时间25毫秒（可设定范围为5-255毫秒）。增加曝光时间可增加荧光信噪比，有助于提高检测性能。但延长曝光时间会产生2个不良后果：一是增加可能引发CCD过饱和，二是增加单次曝光时间后，特定PCR延伸时长内系统数据采集次数须减少（fewer data points are collected in a given extension time），而这将影响检测结果的准确性。若想要维持数据收集次数，则必须增加延伸保持时间。 

       资料表明，ABI PRISM 7700和Viia7系统软件内置算法会在PCR循环的延伸步骤后半段采集的3个数据的平均值来代表此循环的荧光数据信号强度值。延伸的时间至少为30秒，以确保延伸步骤期限完成数据采集操作（For best results, the extension step should be at least 30 seconds to allow collection of sufficient data.） 

       7700系统将这一步时间设定为60s，目的是在首次荧光数据采集前留出39s时间，达到常规三温度循环中退火所需30s时长，确保双链延伸得有效启动和持续一定时间。由于常规三步温度循环法扩增流程中，72℃延伸步骤时间通常不超过30s，不符合7700系统荧光数据采样设计要求。

       因此，众多实时荧光定量PCR试剂使用指南通常会提示，扩增时应根据所用仪器型号来设定延伸步骤的时长。如规定Roche、Bio-Rad和Agilent的qPCR仪的延伸时间不低于15s，ABI 7000/7300时间至少为31秒。 

       《实时荧光定量PCR反应双温循环法的合理性及局限性》讨论了qPCR实验扩增的双温循环法。人们为常规短片段序列专门建立了anneal-extension两步温度循环法。其中一个重要原因就是这样的退火/延伸合并步骤的时间设定具有极大灵活性，既有效满足实验PCR扩增产量和特异性要求，又打破了传统三温度循环法中常用的延伸步骤中的时间长度不够的约束，适应了荧光信号采集的精准度要求。此后，人们在此基础上将60s时间压缩为45s，以缩短qPCR反应时长，提供实验效率。 

二、快速PCR反应模式和多色荧光检测带来的新挑战 

       需注意，7秒间隔和60℃最低维持30秒时长仅是标准反应速度模式下单色荧光检测所需反应条件。 

       如《PCR升降温速度在实时荧光定量PCR实验中的作用与意义-下》所述，若用7500 Fast、QuantiStudio 3/5/6/7、StepOnePlus系统的快速PCR模式，则扩增循环各步骤持续时间大幅缩短，延伸时长不过10-15s。系统须启用Fast模式实施荧光数据采集，即每个循环采集次数不变而缩短采样时间间隔（3秒以内），才能完成数据的有效采集。 

       若要进行multiplex多色荧光实验，每次数据采集前须进行设定荧光通道轮换这一必需动作。我们LightCycler 480实时荧光定量PCR仪为例予以说明。

       LightCycler 480的荧光通道包含6个发射荧光滤镜，安装于步进电机驱动的滤镜轮中。在multiplex分析中，各荧光检测通道是一组组依次旋入旋出检测工位完成相应波长荧光数据的采集。滤镜轮单次切换通道时间约0.65秒，这意味着完成5色荧光检测时，Cyan 500通道信号采集时间点比CY5通道早3.25s，不同检测通道荧光数据的时效性不一。 

       加大滤镜轮直径以容纳更多滤镜的研发成本和进行更多色荧光检测的必要性抛开不论，但检测通道数量增加伴随的技术风险则应引起重视。 

       首先，检测通道轮换时滤镜轮需反复启动、刹车，产生检测时间迟滞。检测通道越多，机械运动延迟也增多，完成全部荧光通道切换所需时间必然增加。 

       其次，也是最关键的，就是荧光通道越多，会造成不同荧光探针标记样品的信号采集时间差距被放大。LightCycler 480系统这一时差将由目前的3.9秒飙升至4秒以上。其结果是，同一反应孔，靶标1检测时间比靶标5时间提前了4秒，意味着靶标1的延伸时间比靶标5足足少了4秒钟。延伸反应时长的差别，势必造成靶标1扩增产物量的在采样点存在轻微差异，从而出现荧光通道测试值“后发优势”偏差现象。 

       其次是，在每轮数据采集时间期限内，CCD数据采集可用时长被压缩。检测通道达到10个以上时，系统须将延伸步骤的首次数据采集时间点提前，或整体延长延伸阶时间，方可有效完成数据采集，这必将使每轮荧光数据检测值随之改变。 

       伯乐CFX系列实时荧光定量PCR仪光学检测系统为光梭式（optics shuttle）结构设计。光梭移动呈“弓”字形轨迹，从A1 →A12 →B12 →B2 →C3 →C12……直至H12完成整板信号采集。采集某一种荧光信号时，步进马达驱动特定检测光路移动到被检测反应孔正上方并精确对准反应孔后再启动荧光的激发和信号采集，随后移出工位。

       资料显示，CFX Opus 96、CFX 96-touch实时荧光定量PCR仪96孔板完成FAM通道扫描耗时3s，完成5色荧光采集所需最短时间为12s（考虑通道切换的时间迟滞，实际时长大于12s）。这表明：CH1通道(FAM)与CH5通道(Quasar 705/Cy5.5)的荧光信号采集时间存在高度异步现象，采样点时差达12s之多。本应与第1个靶标同步数据采集的第5靶标，额外增加了12s延伸反应时间。这必然改变采用不同荧光标记靶标间荧光数据的真实、等效对比。

       Multiplex分析所用荧光检测通道越多，不同靶标荧光数据采集时间差距越大，检测数据组间结果对比的失真现象越严重。 

表1 Optical Detection Performance Specifications of CFX Opus system 

       因此，目前普遍采用的qPCR光学模块结构设计，已对进一步增加检测通道的数量构成制约。 

       除非qPCR借鉴流式细胞仪的固定光路系统和空间立体激发技术。否则，进一步增加荧光检测通道不仅面临研发成本难题，更重要的是会直接危害Multiplex等多色荧光检测实验数据的可靠性、可信性。  

参考文献

［1］MxPro QPCR Software Instruction Manual for Mx3000P and Mx3005P QPCR Systems(Software version 4.10)
［2］ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User´s Manual(904989B,01/2001)
［3］LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5
［4］CFX Opus 96 and CFX Opus 384 Real-Time PCR Systems Instrument Guide