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实时荧光定量PCR反应双温循环法的合理性及局限性
应用驱动型qPCR仪选型攻略-5
常规PCR扩增实验的反应过程无法监测，只有PCR反应结束后，通过凝胶电泳条带图像分析、Southern Blot等方法，可对扩增终产物进行定性及定量分析。因此，相对于实时荧光PCR，人们把常规PCR称为终点PCR (Endpoint PCR)。终点PCR扩增程序通常由经典的变性-退火-延伸三个温度步骤循环组成。
适宜退火温度可确保产物扩增特异性和扩增产能。而有种说法是，PCR反应的退火温度与最适宜温度条件差1℃，会造成非特异性产物的含量升高4倍。故人们历来对PCR反应退火温度的选择、退火和延伸步骤时长的设置慎之又慎。
但实时荧光定量PCR实验的情况似乎不一样。扩增片段长短、引物序列组成和长度差异形形色色，但不管起始模板是cDNA还是基因组DNA，报告荧光基团是SYBR Green I抑或TaqMan探针与FRET双杂交探针，取材来自动植物、微生物抑或临床组织样品，是进行单重荧光检测还是multiplex多重荧光分析，反应条件经常是95℃- 60℃两个温度循环40次的程序设置。给人感觉：PCR扩增条件按实时定量PCR用60℃标准温度就可以，优化引物退火温度多此一举，可以休矣。
表1 two-temperature PCR protocols
反应类型 | PCR热循环条件 | 备注 | 文献出处 |
endpoint PCR | 1 min - 95℃→ 1 min - 58℃→ 1 min - 72℃ 25 cycles | - | Magdalena C Liebl, et al. Nucleic Acids Res. 2021; 49(5): 2759–2776 |
RT-qPCR | 95℃ - 5 min; 95℃ - 5 s → 60℃ - 30s，40 cycles | SYBR Green I dye LightCycler 480 or CFX384 Touch Real-Time PCR System | |
RT-qPCR | 3 min - 95℃ 95℃ - 15 s →60℃ - 45 s，40 cycles | SYBR Green I dye CFX96 Real-Time PCR System | Zheng-Wei Fu, etal. Nucleic Acids Res. 2021; 49(4): 1886–1899 |
RT-qPCR | 95℃ - 10 minutes; 95℃ - 15 s → 60℃ - 60s，40 cycles | SYBR Green I dye ViiA7 Real-Time PCR System | Ross J Hill, et al. Nat Genet. 2019; 51(8): 1283–1294 |
95℃ - 10 minutes; 95℃ - 15 s → 60℃ - 60s，40 cycles | TaqMan probes ViiA7 Real-Time PCR System | ||
RT-qPCR | 50℃–2min → 95℃ - 10min; 95℃–15sec → 60℃- 1min，40 cycles | SYBR Green I dye or TaqMan Probe ViiA7 Real-Time PCR System | Britta Will, et al. Nat Med. 2015; 21(10): 1172–1181 |
Duplex | 50℃- 2min → 95℃- 10min; 95℃ - 15s →60℃ - 60s，40 cycles | ViiA7 Real-Time PCR System | Luca Perico, et al. Nat Commun. 2017; 8: 983 |
Duplex | 95℃- 10 min； 15s - 95℃ → 60s - 60℃，40 cycles | ViiA7 Real-Time PCR System | Scott Gettinger, et al. Cancer Discov. 2017; 7(12): 1420–1435 |
triplex | 30 min - 42℃, 10 min - 95℃； 95℃ - 15s → 58℃- 45s，40 cycles Plate-reading during the 58℃ phase | 7300 Real-Time PCR System | Roujian Lu, et al. Lancet. 2020 22-28; 395(10224): 565–574 |
triplex | 50℃ - 2 min, 95℃ - 10 min; 95℃ - 15sec → 60℃ - 60s，40 cycles | TaqMan probes Real-Time PCR System | Matthias Lübbert, et al. Neuron. 2019; 101(2): 260–273.e6 |
triplex | 94℃ - 10 min; 94℃ - 30s → 62℃ - 45s，45 cycles | LightCycler 480 Real-Time PCR System | Yongqing Tong, et al. J Exp Clin Cancer Res. 2018; 37: 68 |
triplex | 95℃- 20s; 95℃- 1s → 60℃- 20s，40 cycles | StepOnePlus Real-Time PCR System | Karolina A. Rygiel, et al Nucleic Acids Res. 2016; 44(11): 5313–5329 |
quadruplex | 94℃- 10 min; 94℃ - 15s→60℃ - 60s，40 cycles | QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Christian Gaebler, et al. J Exp Med. 2019; 216(10): 2253–2264 |
endpoint PCR | 95℃ - 3 min; 95℃ - 30s →68℃-30s→72℃-30s，35 cycles；5 min - 72℃ elongation | - | Behnoush Hosseini, et al. PLoS One. 2021; 16(9): e0257225 |
quadruplex | 95℃- 3 min; 95℃ - 15s → 60℃ - 45s，40 cycles | SensiFAST Probe CFX96 Real-Time PCR system |
同是进行DNA序列热循环扩增，为何实时荧光定量PCR仪放弃成熟的变性-退火-延伸三温循环法，启用95℃-60℃两个温度循环反应程序？这个貌似 “标准化”的PCR protocol从何而来，是TaqMan探针扩增必然要求，还是受荧光信号检测技术所限不得已而为之？没有双温循环法qPCR还能做吗?
一、双温度循环 PCR程序源自ABI早期TaqMan探针应用经验
如《实时荧光定量PCR仪荧光检测技术融合趋势杂谈》所述，是ABI为TaqMan探针技术落地与应用创建了一整套标准体系，并在ABI PRISM 7700 Sequence Detection System原型机上验证成功。这套体系包括了Primer Express software工具软件、引物探针设计法则、探针检测PCR反应条件等内容。
将退火、延伸步骤整合，并用低于探针Tm的温度作为退火-延伸共享温度（combined annealing/extension temperature）这一方法，可兼顾引物与模板复性与延伸、探针与模板稳定杂交和探针5′端的水解这些关键环节的技术要求。同时，通过优化反应体系中MgCl2浓度，保持探针在较高温度下的杂交稳定性，尽可能地提升AmpliTaq Gold酶合成效能。据此确立了由95℃变性和55℃-62℃退火/延伸1分钟两个温度循环的qPCR扩增程序（ two-temperature PCR protocol）。
在正式ABI PRISM 7700荧光定量PCR仪的运行编程初始模板中，为TaqMan探针定制的热循环条件是：
HOLD阶段：10 min，95℃
CYCLE阶段：Melt step 95℃ - 15 sec，Anneal/Extend step：60℃ - 1 min, 40 Cycles.
其双温循环（two-temperature cycle）包括了一个95℃长15秒的双链熔解（变性）温度步骤 (denaturation or melting step)和一个60℃长1分钟的退火-延伸步骤（anneal-extension step）。
众所周知，实时荧光定量PCR仪与终点PCR仪运行机制的最大区别是实时采集每一轮热循环中的荧光信号。ABI确定以退火-延伸步骤采集的TaqMan探针荧光数据作为分析依据。
为了确保荧光数据采集的准确性，7700系统将经典PCR三温度循环中引物退火和延伸两步合并为退火/延伸一步，这样设计是便于延长共享温度步骤的维持时间，目的是给CCD的多点荧光数据采集提供足够周转时间（可参《实时荧光定量PCR仪检测通道数量扩充的革命来啦？》）。
从7700到随后的7300、7500、StepOnePlus，从Viia7到Quantstudio 5、Quantstudio 6 Pro、Quantstudio 7 Flex，初始编程模板始终是双温循环设置，所不同的只是退火-验收步骤中时间长短有变化。
ABI处心积虑、另辟蹊径开发这一检测方法，是为从TaqMan探针应用技术专利中切自己那份蛋糕。这毋庸置疑，也合情合理。
用ABI技术和质控标准下的商品化引物、TaqMan探针试剂和双温循环法扩增，多数情况下，均可获得良好扩增效果。凭借ABI在实时荧光定量PCR仪领域的领导地位，TaqMan探针检测扩增程序因qPCR仪推广而迅速普及。
人们照猫画虎，将TaqMan探针实验扩增方法拓展到SYBR GRREN I检测中并取得成功，从而造就了如今双温循环法漫天飞舞的盛景。
二、双温度循环扩增法并非法定qPCR实验标准
资料表明，95℃-60℃两步温度循环程序并非正式行业标准。众多实时荧光定量PCR仪厂商也没有将其引入系统初始Protocol设置。
罗氏是TaqMan探针5′nuclease assay技术、PCR核心方法专利所有者，但LightCycler系列定量PCR仪的experiment protocol设定环节，program（步骤）、temperature Target（目标温度）和hold time参数都是开放的。
伯乐Icycler IQ系统在运行设置初始模板中曾引入了双温循环设置。但从CFX 96开始，如CFX 96-Touch、CFX Opus 96实时荧光定量PCR仪等，系统运行编程界面已恢复到用户自主设定PCR反应步骤和温度的界面模式。
Agilent Stratagene MX3000P、Mx3005P运行设置中，初始模板用的依然是95℃变性-55℃退火-72℃延伸的经典三温循环编程设置。
这说明，qPCR实验中，双温循环扩增法的应用在业内并未完全取得一致，是有保留的。
三、实时荧光定量PCR反应双温循环法的合理性及局限性
TaqMan荧光探针信号检测是基于5′核酸酶降解与模板结合DNA的原理。PCR反应条件须同时满足四个要素：
1）引物与模板稳定结合并得以正常延伸；
2）探针与模板结合才能被降解，故PCR延伸过程须在确保探针特异性结合的温度下进行；
3）引物的延伸顺利延伸至探针5′端；
4）探针被切除释放荧光信号。
qPCR技术创立早期实验证明，当扩增片段较小，且引物退火温度与延伸温度相差不超过3°C情况下，95℃的变性步骤不变，而退火、延伸两步合并为60℃一步的改良可行。
与此同时，可以发现该方法的以下特征：
特征1 酶活性不够时间补
60℃明显低于70-72℃的AmpliTaq金牌酶活性最佳温度范围。聚合酶活性降低会造成引物延伸效能下降，用的是延伸时间适度延长的办法予以弥补。
特征2 温度高了MgCl2顶
60℃可能比引物-模板特异性结合温度高，通过改进PCR反应组份引物浓度和优化体系组份的方法可以克服。而此温度条件无疑有助于限制非特异性扩增产物出现，增加PCR反应的特异性。
特征3 以效率代价换专利
双温循环法qPCR扩增程序本质上是赤裸裸地以牺牲PCR扩增效能为代价，来换取TaqMan荧光探针检测技术专利的确立。但技术上总归是有缺陷的。
从表1 Behnoush Hosseini等报道的实验数据可以看出，完成同一个片段的扩增，终点PCR实验采用三温循环法只需35个循环即可达到扩增产物检测用量要求，而在qPCR的双温循环法扩增要40个循环才能出现阳性结果。
人们其实早就认识到，双温循环法有其明确“适用症”限制，它并非包治百病适用于所有靶片段扩增。譬如于长片段样品，双温循环法存在扩增效率低、稳定性和重复性差的问题。有相当一部分实验采用双温循环扩增方法存在困难，且不容易通过优化反应条件、加长延伸时间有效克服。原因可能是两步循环扩增法常用的退火、延伸的温度和时间设置影响了引物的扩增效果有关。
在对白酒发酵菌Lactobacillus sp.的一段445 bp片段的荧光PCR对比实验表明，采用传统变性、退火、延伸三步循环扩增法，扩增结果稳定性高，扩增线性强，检测灵敏度高。
结果显示，三温循环扩增法每个循环时间仅多出25s，加上从55℃退火→ 72℃延伸升温过程耗时（按4℃/s变温速率计算），完成40个循环扩增总耗时比双温循环法多出不过20分钟而已。对符合科研假说的完美阳性结果孜孜以求的科研人员来说，20分钟实验延时有那么难以忍受吗？何况，若采用表1文献中大部分两步法扩增退火/延伸时间维持45s-60s重新评估，单次循环中两种扩增法耗时差距缩短至10s，完成两种实验程序时长差距将无足轻重。
表2 实时荧光定量PCR实验中三步温度循环扩增程序
反应类型 | PCR热循环条件 | 备注 | 文献出处 |
RT-qPCR | 95℃ - 20 s → 60℃ - 20 s → 72℃ - 20 s 45 cycles | SYBR Green I dye Lightcycler 480 II Real-Time PCR System | Seungwoo Cha, et al. Nucleic Acids Res. 2021; 49(2): 745–759 |
RT-PCR | 95℃ - 3 min; 98℃ - 10 s →60℃ - 30 s →72℃ - 6 min 22 cycles | - | Minoru Kubo, et al. Nucleic Acids Res. 2019; 47(9): 4539–4553 |
endpoint PCR | 98 ℃ 1 min 98℃- 10s → 55℃ - 30s → 72℃ - 25s，40 cycles | - | 杜如冰,等. 微生物学通报, 2020, 47(1): 1-12. |
qPCR | 98 ℃ 1 min 98℃ - 10s → 60℃ - 30s，40个循环 | SYBR Green I dye ABI Real-Time PCR System |
即便是双温循环法的qPCR实验，也并非千篇一律用95℃、60℃这两个循环温度。部分论文中采用的是变性94℃、退火延伸58℃方案（见表1）。
实际上，市面部分实时荧光定量PCR探针 (TaqMan，Molecular Beacon等)用的预混试剂，因60℃会抑制所用的热启动酶活性，扩增只能采用三步温度循环法进行。
四、小结
实时荧光PCR实验与普通终点PCR，无论是否加入荧光染料、荧光探针检测，本质都离不开对靶序列的高效、特异性扩增，故经典变形-退火-延伸三个温度步骤循环法，都是适用的。
95℃变性-60℃退火/延伸双温度循环法，是人们遵从体外PCR客观规律基础上、在巨大商业利益驱动下催生的。应秉持科研探索精神，取其精华去其糟粕，正视其特殊应用价值，但不可一叶障目并为之自缚手脚。
参考文献
［1］ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User´s Manual(904989B,01/2001)
［2］LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5
［3］CFX Opus 96 and CFX Opus 384 Real-Time PCR Systems Instrument Guide
［4］MxPro QPCR Software Instruction Manual For Mx3000P and Mx3005P QPCR Systems(Software version 4.10)
［5］杜如冰, 吴群, 徐岩. 基于三步荧光定量PCR技术揭示不同产区白酒酿造系统中Lactobacillus sp.的分布特征. 微生物学通报, 2020, 47(1): 1-12.
