产品课堂
实时荧光定量PCR仪荧光检测技术融合趋势杂谈
应用驱动型qPCR仪选型攻略-4
1991年，美国Cetus公司发明了利用Taq酶5'外切酶活性水解与模板杂交的寡核苷酸探针的方法，并命名为“TaqMan”（据说灵感源自一款叫“Pacman”吃豆人的电子游戏名)。该5’核酸酶处理技术连同PCR核心方法专利权随着Roche并购Cetus后归Roche Molecular Systems所有。
墙内开花墙外香。
Applied Biosystems公司将5' -3'核酸酶降解法与荧光能量转移技术（FRET）结合，开发了用reporter dye (FAM) + quenching dye (TAMRA)双色荧光标记的探针信号系统，并与Genentech、Roche协作在ABI Prism 7700 Sequence Detector上验证取得成功。受益于PCR仪开发基础和专利保护，ABI实时定量PCR仪很快就占据行业领导地位，并极大推动了Taqman探针检测的广泛应用。
Taqman探针技术炙手可热，肥水不流外人田。
不甘躺平数钱（全球PCR和Taqman探针技术专利授权版税）的罗氏，于是另起炉灶弄出个毛细管离心式模块实时定量PCR仪，既要兼容各家不同荧光报告基团标记的Taqman探针，又能给自家两个冷货——双杂交探针（HybProbe Probes）和单探针（SimpleProbe Probes）带货。这在1999-2003年开发的LightCycler系统上表现尤为突出。
表1 Detection Format for the LightCycler Instrument
Model | Excitation filter | Detector Channel | Emission filter | Detection Format |
LightCycler 1.2 LightCycler 1.5 | 470nm / HBW 40nm | Channel-1 | 530 nm/HBW 20 nm | FAM/SYBR Green I |
Channel-2 | 645 nm/HBW 30 nm | LC Red 640 | ||
Channel-3 | 710 nm/HBW 40 nm | LC Red 705 | ||
LightCycler 2.0 | 470nm / HBW 40nm | Channel 1 | 530 nm/HBW 20 nm | FAM/SYBR Green I |
Channel 2 | 555 nm/HBW 20 nm | HEX/VIC/Yellow555 | ||
Channel 3 | 610 nm/HBW 20 nm | LC Red 610/Texas Red | ||
Channel 4 | 640 nm/HBW 20 nm | LC Red 640 | ||
Channel 5 | 670 nm/HBW 20 nm | LC Red 670/Cy5 | ||
Channel 6 | 710 nm/HBW 40 nm | LC Red 705 |
LightCycler 1.2和改进后的LightCycler 1.5均为3检测通道布局：一个5’-核酸酶水解探针检测通道（FAM/SYBR Green I）、2个HybProbe Probes 探针（Red 640和Red 710）专用通道。LightCycler用于常规定量分析还好办，若要开展SNP基因分型探针实验，就只能用罗氏独门暗器。
LightCycler 2.0系统的检测通道数增加到6个，其中有2个水解探针信号通道（FAM/SYBR Green I、HEX/VIC）。另外4个是清一色FRET专用通道，用于Red 610、Red 640、Red 670和Red 710探针的检测。没有对比就没有伤害。测试通道多了固然可解决常规单重定量、多重定量和基因分型实验问题，但封闭毛细管耗材外加高冷专利探针售价，LightCycler 2.0依然饱受诟病。从LightCycler 1.2到LightCycler 2.0，罗氏虽一直在追赶ABI PRISM 7700，就是没有实现超越。
将罗氏从高级腹黑形象中拉出半个身子的是LightCycler 480。
2005年，罗氏部分PCR核心专利到期，与ABI就定量PCR专利一通利益交换后，罗氏首款采用金属热循环模块的LightCycler 480面世，并于2008升级为LightCycler 480 Instrument II。这是罗氏脱掉绅士礼服要光着膀子上阵抢大饼的节奏。
人们汹涌澎湃的qPCR实验习惯，逼着罗氏放下身段，走了一条水解探针与双杂交探针并重的技术路线。LightCycler 480实时荧光定量PCR仪是6个通道设计，但采用的是3个水解探针通道+3个FRET专用通道的1:1方案，裁掉了LC Red 705 FRET通道，新增一个LC Cyan 500水解探针通道。最关键的是，通过新增的533nm、618nm两种激发光源，可以直接检测采用LC Red 610、LC Red 670标记的水解探针信号。
LightCycler 480 II的检测应用模式中，除SNP检测在力推FRET双杂交探针，Endpoint Genotyping 、Quantification应用提供的是常规水解探针方案。
尝试通过检测通路的技术融合来提升平台功能和兼容性的，绝非罗氏一家，且已然成了实时荧光定量PCR仪检测通路技术发展的一个趋势。
伯乐公司，既没有控制PCR仪核心专利，也与TaqMan探针、FRET双杂交探针专利无缘。然而，CFX96 real-time PCR detection system别出心裁，在TaqMan探针检测功能之外引入了FRET探针专用检测通道，系统编程中专门提供了FRET模式选项。这样的拿来主义，既巩固了自身铁粉，又可从ABI、罗氏的饭圈挖墙脚。从CFX9、CFX384开始，到CFX96-Touch、CFX384-Touch，直至最新CFX Opus 96、CFX Opus 384实时荧光定量PCR仪，概莫如此。
也是在2010年前后，ABI一改沿用十余年的光学耦合检测通道技术，开发了Enhanced OptiFlex System（增强型OptiFlex 光学系统）并率先应用于ViiA 7实时荧光定量PCR仪。这个OptiFlex光路系统到底亮点在哪？
传统qPCR荧光检测通路中，一旦设定探针为VIC标记染料，系统自动驱动520nm/560nm这对光学滤镜进入检测工位。
OptiFlex光路单元有6个激发滤片和6个发射滤片工位，但激发、发射过滤组件不再是固定耦合关系，是各自独立。可根据探针标记染料光学特征，可任意将发光滤镜、发射光滤镜组成临时检测通道，还也可以出厂定制特殊激发、发射滤镜。ABI宣称OptiFlex系统可兼容21种常见染料，可使多重荧光检测等应用中荧光染料的选择具有更大灵活性。其实，抛去华而不实和矜持，OptiFlex的设计初衷恐怕有点瞄准罗氏FRET探针检测的成份。
罗氏探针难道真的可以在搭载了OptiFlex光学通路的ABI实时荧光定量PCR仪上检测吗？这是个好问题。
FRET双杂交探针中的Acceptor，如LC Red 610、LC Red 640、LC Red 670、Cy5等，本质就一个普通荧光信号Reporter。并非只有498nm激发光源和通过Donor-Acceptor能量FRET这一种检测途径，还可以直接用533nm、580nm、618nm激发光源和相应的610nm、640nm、705nm荧光滤镜采集荧光信号。选择与FRET探针检测匹配的激发、发射滤光片有机组合固然可以实现HybProbe Probes完美检测。而绕过FRET机制中的Donor荧光素，直捣黄龙激发探针的reporter荧光基团和检测，可行性是毫无疑问的。
表2 Filter Set of the LightCycler 480 Instrument
Fluorophore | Excitation Filter | Emission Filter | Detection Format |
LightCycler Cyan 500 | 440 nm / HBW 35 nm | 488 nm / HBW 20 nm | Hydrolysis Probes (Reporter) |
Fluorescein (Fluos/FAM) | 465 nm / HBW 25 nm | 510 nm /HBW 20 nm | Hydrolysis Probes (Reporter) HybProbe Probes (Donor) SimpleProbe Probes |
498 nm /HBW 40 nm | 580 nm /HBW 20 nm | Hydrolysis Probes (Reporter) (only use with Cyan 500) | |
LightCycler Red 610 | 533 nm / HBW 25 nm | 610 nm / HBW 20 nm | Hydrolysis Probes (Reporter) |
498 nm / HBW 40 nm | 610 nm / HBW 20 nm | HybProbe Probes (Acceptor) | |
LightCycler Red 640 | 498 nm / HBW 40 nm | 640 nm / HBW 20 nm | HybProbe Probes (Acceptor) |
Cy5 / Cy 5.5 / LightCycler Red 705 | 618 nm / HBW 35 nm | 660 nm / HBW 95 nm (low pass) | Hydrolysis Probes (Reporter) |
498 nm / HBW 40 nm | HybProbe Probes (Acceptor) |
LightCycler 480 Instrument II仅用498nm、533nm、618nm三个激发滤镜与610nm、640nm、660nm、670nm四个发射荧光滤光片即组成了FRET探针检测标准解决方案。这对于激发、发射模块可自由组合的OptiFlex光路系统而言，构建相似方案绝非难事。
表3 Instrument filters and supported dyes
通道 | CH1 | CH2 | CH3 | CH4 | CH5 | CH6 |
激发滤光片 | 470±15nm | 520±10nm | 550±10nm | 580±10nm | 640±10nm | 662±10nm |
可激发染料 | LC Red 610 LC Red 640 LC Red 705 (FRET) | LC Red 610 (Reporter) | Cy 5.5 LC Red 705 (Reporter) | |||
发射滤光片 | 520±15nm | 558±12nm | 586±10nm | 623±14nm | 682±14nm | 711±12nm |
可检测染料 | LC Red 610 LC Red 640 | LC Red 670 Cy5 | Cy 5.5 LC Red 705 | |||
ViiA7 | ● | ● | ● | |||
QS 5 | ● | ● | ● | |||
QS 7 Pro | ● | ● | ● | |||
QS 7 Flex | ● | ● | ● |
ABI的ViiA7 、QuantiStudio 5（QS 5）、QuantiStudio 7 Pro （QS 7 Pro）、QuantiStudio 7 Flex （QS 7 Flex）和QuantiStudio 12 Flex实时荧光定量PCR仪，标准配置为非藕联的光学测通道配置（decoupled six-by-six-color filter set），可以轻松完成Ex498 nm/Em623 nm(LC Red 610、LC Red 640)，Ex498 nm/Em682 nm(LC Red 670、Cy5)和Ex498nm/Em711 nm(LC Red 705、Cy5.5)的FRET探针光学检测通路的组建。
另外，FERT探针荧光信号采集的时间点是在探针与扩增片段结合阶段，即退火/复性阶段。这与ABI默认退火/延伸阶段信号采集设置是一致的。
FRET双杂交探针通道数据采集持续约10-46ms。如果QuantiStudio 系列平台与ABI Prism 7700荧光定量PCR仪CCD默认曝光时间基本一致（即25ms，有待核实），而CCD的分辨率、动态监测范围、信号检测灵敏度等技术指标接近或优于LightCycler 480检测单元相关参数，同样符合测试要求。
表4 LightCycler Instrument’s Specifications for the Detection System
Model | LightCycler 1.5 | LightCycler 2.0 | LightCycler 480 | ABI Prism 770 |
Detector | Photohybrid Resolution 12-bit | Photohybrid Resolution 16-bit | Cooled monochrome CCD Resolution 1024×1344 pixels | CCD camera |
Integration Time | 20 ms/capillary | <46 ms/capillary | Dynamic Mode： | 25 ms/color (5 to 255 ms) |
因此，参考LightCycler 480相应检测通道设置，立足于现有的QS5、QS7、QS 12和ViiA7实时荧光定量PCR仪进行FRET探针信号检测的尝试与探索，在特殊条件下，是有积极意义的。
自从有了ViiA7，或更准确点说是打用上解藕联式（decoupled color filter set） OptiFlex光学通道，ABI定量PCR仪用户再也不用为FRET检测发愁了。
参考文献
[1] P. Mickey Williams. The Beginnings of Real-Time PCR. Clinical Chemistry, 2009; 55:4833–834
[2] LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5
[3] LightCycler 1.5 Instrument Operator’s Manual (Version 1.0)
[4] LightCycler 2.0 Instrument Operator’s Manual A (Software Version 4.1)
[5] ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User´s Manual (904989B, 01/2001)
[6] QuantStudio 3 and 5 Real-Time PCR Systems Installation, Use and Maintenance (Revision C.0)
