实时荧光定量PCR仪荧光检测通道数量的内涵浅析

应用驱动型qPCR仪选型攻略-3

       实时荧光定量 PCR 仪的荧光检测单元通常包括了宽谱基础光源、入射激发光模块、发射荧光模块和荧光信号采集数码相机等基本组件。针对特定荧光基团的光吸收、荧光发射光谱特征，将最适的激发光滤镜模块、发射光滤镜模块藕联，组成了波长范围固定的光学通道用于采集荧光信号。每一色荧光对应一个专用通道，如FAM/SYBR GREEN青-绿色光通道、VIC/HEX/TET绿-黄绿通道等，可确保检测灵敏度与准确性。

       曾经，人们把荧光定量PRC仪内部这样一个光学通道称为一“色”，并按通道配置数量在仪器名称中加以区分。如1995年推出的ABI PRISM 7700 Sequence Detection System实时荧光定量PCR仪，配有FAM, JOE, HEX及TET四个检测通道，称为4色定量PCR仪。DNA Engine Opticon 2只配置了用于SYBR Green I /FAM、HEX/TET/ VIC/TAMRA两种波长荧的光检测通道，故名Two-Color Real-Time PCR Detection System。如今，新型qPCR仪诸如QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Pro，CFX96-touch、CFX Opus 96、LightCycler 480 II等，荧光检测通道数量达到6个，却不见人用6色实时定量PCR仪来冠名。

       是什么削弱了荧光定量PCR系统检测通道的数量与可检测荧光色数之间的联系？6通道qPCR仪能进行6色荧光的检测吗？

一、ROX参比荧光校正占用了屈指可数的荧光检测通道资源

       对于qPCR定量实验中引入ROX参比荧光对报告基团荧光信号及非PCR反应造成的荧光信号波动均一化（Normalization）的必要性，业内外历来是仁智互见、各执一词。

1.1 qPCR实验ROX校正有用论

       支持加入ROX参比荧光校正者认为，在实时荧光定量PCR实验中应用ROX荧光染料的意义，至少有4个方面：

       1.1.1 校准各孔反应体系构建时PCR组份移液加样操作误差，消除反应浓度或体积变化引起的孔间荧光信号强度波动；

       1.1.2 将同一次运行中全部报告荧光基团信号的强度均一化，校正不同位置反应孔释放的荧光信号因与CCD间光程不同引起的强度误差；

       1.1.3 消除仪器检测器本身噪音引起的荧光信号波动，同时为多重实时荧光定量PCR分析提供稳定基线；

       1.1.4 ROX染料不干扰实时荧光定量PCR反应扩增效率和特异性、报告荧光基团的信号检测。

       TaqMan Universal PCR Master Mix（TaqMan 通用实时荧光定量PCR预混试剂）、TaqMan Fast Advanced 预混液中都含有ROX染料。读取ROX校正荧光信号要单独占用一个检测通道，则待测试样品检测探针不能采用与ROX具有相同光谱特征的报告荧光染料，结果必然是样品可用的荧光信号采集通道减少一个。这在multiplex多色荧光定量实验设计中尤其重要。使用4通道的StepOnePlus荧光定量PCR仪最多能在单管内进行同时扩增3个靶序列。若要完成4重PCR定量分析（quadruplex qPCR assays），就需采用像7500、7500Fast、QuantiStudio 5、QuantiStudio 6/7Pro、QuantiStudio 6/7 Flex 和CFX 96 Touch、CFX Opus 96等配置更多色荧光通道的平台上进行。

1.2 qPCR实验ROX校正无用论

       也该观点的认为荧光定量PCR实验中引入ROX参比荧光校正毫无意义。

       理由主要是：

       1.2.1 定量实验的反应体系包括了通用PCR扩增预混试剂、正反向引物对、探针、样本或标准模板在内多种组份。对组份的加样操作误差是客观存在的，几乎是每一轮组份的加样移液，本质上都是在引入并不断积累误差。

       以PCR实验常用的微量移液器为例，视单次移液量和所用的移液器规格不同，每次操作都可能存在1-2.5%甚至更高的系统误差、0.3-1.5%的随机误差。

表1 常用单道可调量程微量移液器加样误差表

（数据来源于eppendorf官网）

       事实上，反应组份越复杂、手工操作次数越多，系统误差、随机误差和人为操作精度误差综合后必造成各反应孔最终扩增体系的体积、组份浓度的细微区别。通过改进操作仪器精度、操作熟练程度、提高PCR反应体系构建的自动化程度，误差固然可以缩小。但移液加样误差单靠PCR预混试剂中ROX信号强度归一化是无法有效消除的。大量实验也证明，即便依然存在误差，只要控制在一定范围内，不会对实验结果产生根本性影响。因此，添加ROX组份可视作一种无用功。

       1.2.2 不同品牌型号实时荧光定量PCR仪的光学检测单元结构设计存在区别，对采用ROX信号校正PCR反应板各孔荧光信号光程误差的必要性是完全不同的。

       伯乐CFX 96-touch、CFX Opus 实时荧光定量PCR仪的光学检测系统为光梭式设计（optics shuttle）。光梭移动呈现“弓”字形轨迹，从A1 →A12 →B12 →B2 →C3 →C12……直至H12走完整板全部96个反应孔。

        当采集某一孔的某种荧光信号时，光梭中的步进马达驱动特定光学通道移到被检测PCR孔正上方精确对焦，再启动激发、荧光信号采集。不同检测通道、不同反应孔是等距扫描和信号采集，不存在反应孔间荧光光程和误差问题，故无需引入ROX校正。

       既然无需ROX参比荧光，则与之对应的560-590nm波长检测通道就可用作Texas Red/CAL Fluor Red 610这类报告荧光探针检测信号采集。在伯乐CFX Opus 96 real time PCR Detection system可选择FAB、HEX/VIC、Texsa Red、CY5和CY5.5组合完成分别用5种颜色标记探针实施5个靶基因的同步检测。

       对引入ROX参比信号校正存在的截然相反意见且各自所指导的qPCR实验已践行多年，故qPCR仪运行编程界面都有ROX设置选项，便于实验者基于自身经验和试剂使用说明自由决定。

       因此，不同品牌型号qPCR仪，如Applied Biosystems 7500 VS  Stratagene_Mx3500P，虽均为5个检测通道，但在实际使用中，因不同实验、不同探针和配套试剂不同，在Multiplex多色定量分析中可同时检测的靶标种数可能不同。

        简单地将系统检测通道数量与Multiplex反应中荧光色数挂钩划等号不仅没有意义，反而有犯错的风险。

二、FRET探针检测引入使qPCR仪多色荧光检测通道“灌水”

       罗氏LightCycle系列 FRET探针，又称双杂交探针（HybProbe Probes），由两条分别能与靶片段上下游两个相距1-5bp的特异结合位点互补的探针组成。上游探针3`端标记的是荧光素（Fluorescein），作为下游探针荧光能量的供体(Donor)；下游探针5`端标记受体荧光基团，如LightCycle Red 610、LightCycle Red 640和Cy5等，作为FRET效应的能量传导受体(Acceptor)。

       在PCR循环的复性阶段，两条探针同时结合到靶片段上。上游探针末端供体基团被入射光激发产生荧光。此时因供、受体基团紧紧相邻而发生FRET反应，受体基团吸收供体发出的绿色荧光能量后以波长更长的黄色、橙色或红色荧光释放出能量。系统检测器通过优化的滤光片配置，滤除上游供体基团发射的荧光，只采集下游受体释放的荧光信号用作分析。

       以LightCycler 480 II的Mono Color HybProbe 检测模式为例。采用HybProbe Fluorescein (Donor) +LightCycler Red 640 (Acceptor)探针组。采用498nm初始激发光源激发供体，释放510 nm波长的荧光，经FERT机制能量被受体吸收后，Red 640焕发640 nm波长的荧光。而CCD前端配的正是618-660nm带宽Emission Filter而非常规FAM/SYBRGreen I检测通道用的510 nm滤光片，可以有效滤除供体残余荧光信号。常规FAM/SYBRGreen I专用荧光通道无法检测HybProbe探针FRET荧光，而FRET检测通道只能为HybProbe探针提供专享服务。

       若要进行FAM和Red 640组合的单管多重实时定量分析，qPCR仪必须同时具备常规FAM/SYBRGreenI检测通道和Fluorescein-LightCycler Red 640专用通道。两种检测通道的前端入射激发光模块相同，但后端发射荧光滤光模块不同。本质上，FRET检查波长与常规TaqMan检测波长是重叠的。如Red 640专用通道检测波长的范围(618-660nm)就与常规TaqMan探针ROX、Texas-Red所用的红色荧光波长（623±14nm）基本重叠。两种探针竞争检测波长资源，则必然造成因荧光信号窜扰（Cross-talk）而干扰检测结果的问题。

        鱼（TaqMan等水解型探针）和熊掌（FRET探针）只能二选一：每增加一个FRET专用通道，则要有一个TaqMan信号通道被替换掉。

三、实时荧光定量PCR仪检测通道与multiplex多色检测能力的区别与联系

       20多年前，具有超凡远见卓识的实时荧光定量PCR仪先驱开创了4荧光检测通道的配置架构，使采用FAM+VIC双色荧光探针进行单核苷酸多态性检测（SNP Assays）和在单管内多个基因同步检测分析（multiplex）方法成为现实。

       系统配置的光学通道数量越多，多色荧光检测应用越灵活。

        但检测通道数与可同步检测荧光信号种数之间既联系又有区别。原因就在于qPCR仪厂商、实验者对ROX荧光参比校正应用、荧光共振能量转移（FRET）探针检测功能要求的不同。

表2 实时荧光定量PCR仪荧光检测通道与多重PCR反应对比表

       在不引入ROX荧光参比校准情况下，CFX96-touch、CFX Opus 96系统名义上是6个荧光检测通道，但实际至多可进行5色多重定量检测，与配置5个荧光通道的7500 Fast系统最大检测范围相当；而同属3通道配置经济型实时荧光定量PCR仪，CFX Connet只能进行Duplex，但QuantiStudio 1最多可进行triplex定量分析。

       尽管LightCycler 480 II具有6个检测通道，但在多重定量模式下，由于FRET探针的上游供体荧光基团Flourescin需占用FAM标记探针激发通道，同时Flourescin发射光谱（515-530nm）与VIC/HEX/CAL Fluor Gold 540/Cal Fluor Orange 560/TET等第二个常用荧光通道激发光谱（515-535 nm）重叠，势必会削弱FRET探针中Donor激发能量，因而须关闭VIC/HEX荧光通道。可见，因为荧光激发通道、检测通道工作光谱间的严重重叠干扰（“内卷”？），LightCycler 480系列最多只能进行4重定量检测（4 Colors Hydrolysis Probes Assay Detection Format）（LightCycler Cyan 500：Ex 440nm/Em 488nm；FAM：Ex 498nm/Em 580nm；LightCycler Red 610：Ex 533nm/Em 610nm；Cy 5/Cy 5.5：Ex 618nm/Em 660nm）。若完全基于FRET探针实施multiplex实验，最多能执行三重定量反应（Fluorescein-LightCycler Red 610, Fluorescein-LightCycler Red 640, Fluorescein-Cy 5/Cy 5.5）。

（图片来源https://lifescience.roche.com/en_cn/articles/lightcycler-480-detection-formats.html）

       可见，曾经流行的将检测通道数与多重定量PCR荧光色数直接“藕联”形成的“N色实时荧光定量PCR仪”概念已是名不副实、漏洞百出，甚至有混淆误导视听之嫌。目前，实时荧光定量PCR仪检测适用范围，已不再沿用可检测几色荧光的说法，而是用标注系统可支持的报告荧光基团的列表的方式取代。

       讨论到这，我们似乎可以回答本文开头提出的问题了，实时荧光定量PCR仪能用于6色荧光检测吗？定性分析是可以的，若不引入ROX荧光校正设计的话，用于6-target的多重定量检测也无妨，但如采用的是赛默飞原装Taqman预混试剂和探针组合，那只能实现5色定量分析。

参考文献

ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User´s Manual(904989B,01/2001)

实时荧光定量 PCR 手册

The LightCycler 480 Real-Time PCR System Brochure(2014)

LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5

CFX Opus Real-Time System（Bulletin 7279）