扩增条件再优化在实时荧光定量PCR实验中的意义和有效途径-下

应用驱动型qPCR仪选型攻略-2

二、在等温循环模块qPCR仪上优化PCR反应的有效途径
        eppendorf、MJ Research和伯乐等是梯度温度qPCR仪路上的先行者。ABI是在2007年VeriFlex模块投产后才步入梯度时代，StepOne和StepOnePlus是其标志。在梯度温度模块大规模应用前，科学家们手里的普通终点式PCR仪和实时荧光定量PCR仪，都配的是等温循环模块。
        死了张屠户，要吃浑毛猪。没有梯度温控模块，科学家们并非在复杂模板扩增时束手无策，或为摸索有效退火温度就只能进行N轮扩增实验。
        实际上，早在1991年，一套行之有效的PCR优化方法-降落PCR技术（touchdown PCR，TD-PCR）就诞生了。TD-PCR技术是与常规缓冲液组份浓度、循环条件和在梯度模块上改变退火温度等常规优化策略完全不同的提高PCR反应特异性的方法。
        其工作原理是：在PCR初始阶段，退火温度高于估计Tm值，此时扩增效率低但可避免非特异性PCR产物产生。随着循环进行，退火温度递减，当“降落”至引物-模板结合最佳温度时（通常比Tm低3-5℃），特异性扩增开始。随后退火温度进一步降低，特异性扩增与非特异扩增齐飞。但凭借先发优势，经过2个循环扩增，特异性扩增产物已实现绝对的数量优势，对任何其后出现的非特异扩增产生强烈竞争抑制而处于单一主导地位，确保了在剩余进程PCR扩增特异性和扩增效率。
        经典TD-PCR程序编辑方法是：从高于引物-模板退火温度熔解温度（Tm）值开始，到退火温度低于Tm值若干为止的范围，按每个步骤重复2次、相邻的2X步骤退火温度依次比上一个2X步骤递减1-2℃，直到退火温度设定底限为止的方法，设置热循环程序前面2N个连续循环步骤。从2N+1开始的剩余循环统一按第2N步骤参数执行。

        以2010年J Nucleic Acids刊文中的TD PCR程序为例：
Stage 1：95℃预变性30s;
Stage 2：95℃变性30s→56℃退火30s→72℃延伸1min
Stage 3：每个循环退火温度降低2℃,从56℃降落到46℃共5个循环;
Stage 4：95℃变性30s,44℃退火30s,72℃延伸1min,完成余下29个循环
Stage 5：72℃延伸10mn;
总计35个循环。
        TD-PCR在配置等温热循环模块的普通PCR仪和实时荧光定量PCR仪上就可以实施。同一批常规样品、同一台机器同一个运行程序，只需一次运行即可完成特异性扩增。
        TD-PCR方法作为基本功能，很早就被融入主流厂商PCR、qPCR仪的程序编程环节。如Agilent SureCycler 8800 PCR仪，设有专门Touchdown PCR设置选项。只是不同机型TD-PCR编程操作界面及简易程度有别。

        目前，Applied Biosystems旗下的qPCR仪，无论是否配置梯度温度模块，都采用了AutoDelta选项专用于Touchdown PCR编程设置。如QuantStudio 6 Pro/6 Flex、QuantStudio 7 Pro/7 Flex实时荧光定量PCR仪，在退火步骤编程界面设有Enable AutoDelta选型（图中蓝色箭头所示）。
 

        激活选项后会弹出AutoDelta设定界面。指定TD步骤起点、TD温度降幅和时间递变幅度、每个温度重复次数即可，程序设定操作简便。

         伯乐CFX Opus 96、CFX Duet、CFX 96 touch等qPCR仪在触摸屏、PC操作端的编程界面中都有GOTO功能，可用作TD程序设定。

        点击Insert选项，选择在图中95℃-10sec位置依次用Insert Step命令插入退火参数、延伸步骤参数、读板，以GOTO命令设置重复步骤起点、循环次数完成第一个TD设置。此后在第一TD步骤之后依次插入第二步TD变性、退火、延伸、读板和GOTO步骤完成第二个TD设置，以此类推完成整个TD程序设置。
        TD-PCR特殊的特异性扩增优势，可在非特异性背景极高情况下特异性的PCR表现及扩增物的稳产高产。特别适用于常规PCR循环程序难以克隆的复杂基因组DNA模板的扩增，在同时使用几种非特异性引物情况下还成功地从基因组DNA中扩增出目的扩增子，证明TD-PCR超凡的抗干扰能力。国内外将TD-PCR应用于STR标记遗传鉴定、基因多态性分布、启动子的克隆及表达研究、多重降落PCR检测的案例多至难以枚举。有人还将采用TD-PCR方法的qPCR实验命名为TD-qPCR。

三、实时荧光定量PCR实验反应条件再优化的必要性
        MQIE指南规定qPCR实验应标明完整反应条件、qPCR品牌型号信息及热循环详细参数。而实验的外部环境（如地理位置、海拔高度、气候条件、实验环境）和内部条件（如qPCR仪型号和模块配置、反应体系组成和体积等）都制约PCR热循环模块的温控实效表现。而qPCR仪扩增模块变温特征不同会影响实验结果的一致性。现实条件下的两个独立实验中，要使仪器温控性能状态一致、实验结果精准重现，难度超乎想象。
        将普通PCR反应扩增参数跨平台植入到实时荧光定量PCR实验中运行，是前提条件的，即普通PCR仪热循环模块和qPCR配置反应模块同款。如将C1000 Touch 96-Well Fast PCR仪的参数嵌入CFX96 Touch qPCR仪可以考虑，因为后者扩增模块正是C1000 Touch 96-Well Fast模块。但若将Mastercycler pro梯度模式下所得参数嵌入7500、QuantStudio 1或QuantStudio 6 Flex的运行程序，因彼此间控温特性截然不同，此方法固不可取。
        qPCR实验不仅包含普通PCR反应全部要素，还叠加了荧光检测条件和性能差异。何况，同一个模板添加SYBR Green l荧光染料、Taqman探针、FRET杂交探针后的qPCR反应与常规普通PCR反应，最适退火温度是否发生变化，缺少足够硬核支持证据，尚无定论。因此，qPCR实验参考前人条件基础上，关键还是基于实际qPCR仪性能进行必要的条件验证优化，这本是qPCR实验内在规律的必然要求。
        实时荧光定量PCR仪，无论是配置梯度温度功能模块的StepOnePlus、QuantStudio 3、QuantStudio5、QuantStudio 6 Pro、QuantStudio 7 Pro等，以及伯乐的CFX Duet、CFX Opus 96/Opus 384、CFX96/CFX384 Touch，还是采用等温反应模块机型QuantStudio 1、QuantStudio 6 Flex、QuantStudio 7 Flex、7500 Fast，在软件编程环节，都兼顾了常规引物退火温度梯度编程和TD-PCR程序编辑功能。不仅可自由设定反应步骤、每步温度、保持时间、是否采集荧光信号等基本参数，还提供了梯度退火温度、AutoDelta（GOTO重复循环）等高级编辑功能选项，便于量身创建高效可靠的qPCR实验运行程序。

四、qPCR反应条件再优化需求对实时荧光定量PCR仪选型的指导意义
        梯度温度控制和Touchdown降落PCR是PCR扩增条件优化工作中的常用技术手段。
        TD-PCR特异性高，善于应对复杂反应体系、模板的扩增。模块温控均一性好，则扩增过程中样品变温步调一致，无需纠结于退火温度的准确值。实验者根据引物序列条件制定退火温度的上、下限范围（以40℃-65℃常见）后，据温度递减幅度（1℃-3℃居多）确定具体Touchdown台阶数量和每个降落台阶重复次数（1X-3X为主）。在目前多数PCR仪、qPCR系统上都可以实现，操作简便，可重复性好。编程界面直观简便程度因品牌机型而异。从调研结果看，QuantStudio系列机型TD编程要更简便。
        梯度温度优化技术，有其固有局限性，“算法模拟”退火温度和实际温度游离，始终处于模糊状态，适度缩窄退火范围，缩小算法温度梯度落差，可提高梯度温度示值的可信性。虽是后起之秀，但编程设置实现傻瓜化。厂商以此为卖点竞相宣扬，热捧之下很快成了家喻户晓的流量明星，风头盖过TD-PCR。所谓新人胜旧人，发展到言PCR必称温度梯度的地步。但技术本身的颜值，春华秋实，如此而已。
        关于qPCR实验条件再优化必要性和有效途径的探讨，对制定实时荧光定量PCR仪选型方略的启示在于：
        首先，在PCR编程智能化背景下，TD运行程序设置已极大简化。选型时应视野开阔、兼容并蓄、博采众长，不能完全为实验习惯和唯梯度论所囿。

        其次，因地制宜，基于实验室PCR条件资源，多考虑如何创造有利条件，实现运行参数在普通PCR仪和实时荧光定量PCR仪间的跨平台有效衔接。
        譬如，就现有伯乐C1000 touch 96-well Fast考虑与CFX-96 touch qPCR的对接，而Veriti Pro 96-Well (96×0.2ml，6.5℃/s)可以尝试与QuantStudio 3、QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro/6 Flex、QuantStudio 7 Pro/7 Flex等几款配置有96×0.2ml、6.5℃/s规格veriFlex模块的定量PCR配套使用。旧Veriti (96×0.1ml，5.0℃/s) 扩增仪与StepOne Plus (96×0.1ml，6.5℃/s)，虽然都采用的是96×0.1ml的veriFlex模块，但最大升温速度(5.0℃/秒VS 6.5℃/秒)和平均变温速度(4.25℃/秒VS 2.2℃/秒)存在明显差异，运行参数衔接后扩增效果可能难以做到尽如人意。
        从目前看，行业头部厂商显然已意识到新上市产品的PCR模块间的有效兼容，对于实验运行协议跨平台转移的重要性。这似乎代表着实时荧光定量PCR仪的一个发展趋势。

参考文献
[1] VeriFlex热循环温度控制技术（Applied Biosystems）
[2] Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, et al. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic Acids Res. 1991;19(14):4008.
[3] Hecker KH, Roux KH. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in TD and SD PCR. BioTechniques. 1996; 20(3):478–485.
[4] Tian-Yun Wang,Li Guo, Jun-he Zhang. Preparation of DNA Ladder Based on Multiplex PCR Technique. J Nucleic Acids. 2010; 2010: 421803.
[5] CFX Maestro Software User Guide Version 2.0
[6] Agilent SureCycler 8800安装和用户指南C2版(2015年10月)