扩增条件再优化在实时荧光定量PCR实验中的意义和有效途径-上

应用驱动型qPCR仪选型攻略-2

        采用SYBR Green I染料的实时荧光定量PCR实验，须通过熔解曲线分析鉴别引物二聚体或非特异性扩增产物。然而RNA和基因组DNA具有高度遗传多态性，非特异同源物不仅对靶片段扩增产生竞争抑制，当特异和非特异性扩增产物的Tm值接近时，解离曲线单峰形状还难以有效区分。此外，qPCR实验经常出现扩增曲线的基线期过长、指数增长期出现晚且曲线低平、Ct值偏大现象，一般视为扩增效率过低的表现。
qPCR实验扩增效率和特异性问题，在排除引物设计不当、模板片段过长或数量过少、样品中存在酶活性抑制、同源物竞争抑制等反应组份的因素后，常尝试用恢复变性-退火-延伸三步法扩增程序、调整优化退火温度的办法来解决。
        对于普通PCR实验优化引物退火温度实属老生常谈。有人认为，在梯度PCR仪上摸出最佳退火条件后，将参数直接嵌入qPCR仪运行程序就行了，无需作条件再优化的无用功。这种观点不全对，因其成立是有严格条件限制的，对多数实验环境并不适用。我们来就实时荧光定量PCR实验反应条件优化的议题展开讨论，以图澄清一些似是而非的观点，并从中领略对qPCR实验和选型的有益启示。

一、传统PCR热循环模块梯度温控原理与局限性
        梯度PCR通常指在引物退火温度不明确、扩增效果不理想的情况下，借助于PCR仪内置算法在一定温度范围内，从高到低依次生成一系列差异化温度，作为模块中不同位置各组样品退火温度，进行同步扩增，最后根据扩增特异性、扩增产物含量优选出引物最适退火温度，用做正式扩增参数。
        自eppendorf首开PCR仪温度梯度控制技术先河，引物退火温度优化与模块梯度温功能就被紧密关联起来。而均一金属模块实现梯次差别化温控的原理，业内长期讳莫如深。
        2017年，一份Applied Biosystems发布的测评文件揭开传统温度梯度控制的技术原理。
        文件有3个要点：
1.1 PCR梯度温度模块结构决定了其固有缺陷
        PCR模块温度梯度控制单元的构造，通常是样品模块底部两端分设1个单独加热/冷却元件。均匀一体的金属模块只能有效控制两端设定的高、低两个起止点的温度，而模块中间大部区域的温度，完全受热力学传导规律支配，是模块两端高低温区相互作用自然形成的，无法实施有效控制。

1.2梯度温度值是理论预测值而非真实退火温度
        除Bioer GeneMax PCR仪、Agilent 等少数机型，大部分常见PCR金属模块上温度间梯度落差不均匀，温度值落差曲线呈中间高两头低的峰型。

        资料显示，伯乐T100、S1000、C1000-touch是以行的形式生成8个梯度，而eppendorf Mastercycler nexus则按列的方式从左到右依次形成12个梯度温度。
        将技术资料示例图中的温度值转换成梯度序号-梯度温度散点图后，结果显示，梯度温度分布曲线确实为两端平缓、中间近似线性走势的形状，与qPCR实验中低效扩增曲线神似。
 
        在梯度PCR反应参数设定环节，将梯度范围的高低两端温度值输入后，系统立即显示出不同样品区域温度值。说明，这一系列数值只是计算理论模型的预测值。

 
1.3 由算法模型生成的区域梯度温度与实测值均存在不同程度偏差。
        T100 PCR仪偏差+0.6℃ @50℃，Mastercycler Nexus PCR仪偏离–0.4℃ @61.8℃。
        当今PCR仪热循环模块35℃～99.9℃范围控温精度已达到±0.2-0.25℃，而测评中样品实际退火温度与梯度模型理论计算值的偏离程度达到0.4℃-0.6℃，已远超系统正常温控误差范围。表明，系统梯度算法模型生成梯度温度是不受控制的，并非样品所处的真实温度。
        以图中第6列59.4℃与第7列60.6℃为例，综合考虑算法误差0.4℃、模块控温误差0.2℃后，59.4℃与60.6℃两列样品实际温度很可能是重叠的。
        因此，仪器梯度温度示值，只能视作特定实验条件下接近于引物实际退火温度的理论值之一，而非确定值。不同品牌仪器梯度模型算法的不同，计算误差有别。故换台机器进行同一个样品梯度实验，最佳退火温度的示值很可能会发生偏移。
        将特定条件下梯度示值认定该引物最适退火温度推而广之，跨平台照搬重复实验，在理论上确有刻舟求剑之虞。
        实际上，除了平台间引物退火温度算法误差造成温度界定模糊，正如《PCR升降温速度在实时荧光定量PCR实验中的作用与意义-下》所论，不同PCR模块变温速度特性不一，同样对对跨平台移植PCR运行程序的实验结果产生干扰。
        关于PCR变温速率控制技术优劣问题，业内意见分为两派，一派是ABI、伯乐等代表的“动态变温速率”派，另一派是eppendorf代表的恒速变温派。 
        1）恒速变温派认为，PCR热循环模块在变形-退火-延伸循环的变温曲线斜率应该保持恒定（即SteadySlope），这样确保采用SteadySlope技术的平台间可以相互复制运行协议，机器运行状态保持一致，无需重新优化退火条件便可确保扩增的完美重复。相反，若其中一台机器缺乏SteadySlope控制，即便运行相同protocol，也因变温速率特性不同，造成运行状态的差异和实验结果不一致。

         2）动态变温派则认为，动态变温曲线控制技术优点显而易见：确保运行相同协议时，模块温度转换进程的相同时间内同步抵达不同梯度温度而非梯次到达，确保各梯度温度的维持时间保持一致。而恒速变温由于所有梯度进程的变温速率相同，造成温度跳转“里程”差，不同样品在退火温度环节保持时间出现差异：梯度值高的样品退火温度保持时间最长，梯度值低的样品保持时间最短。梯度温度保持时间的差异，必然影响各组的扩增效果，从而影响优选温度的可靠性。

        其实，无论是SteadySlope技术，还是动态变温技术，想让PCR运行协议跨平台移植共享都是有前提的，即不同平台循环模块升降温特征的基本一致。如QuantStudio 3、QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪均配置了通用96×0.1mL快速反应模块， 二者间多数qPCR协议就可以相互传递直接运行。但若该协议植入StepOnePlus或CFX Duet、CFX Opus 96/CFX96-Touch中运行，要取得一致实验结果，则绝非易事。
        为适应PCR运行程序跨平台应用需求，厂商开发了热力学模拟功能模式 (Simulation Mode)，即A机通过模拟B机的升温速率以便获得一致扩增结果。如VertiPro PCR仪模仿Veriti、9700、C1000-touch、T100等多个品牌热循环仪的升温核心特征，导入被模拟对象上运行程序直接启动实验。

         模拟功能具有向下兼容的特点，只能模拟变温速率相对低的机型，范围限于普通PCR仪，qPCR系统尚不适用。

（待续）