PCR升降温速度在实时荧光定量PCR实验中的作用与意义-下

一、样品模块的变温速度决定PCR实验效率
MIQE指南成文之时，Applied Biosystems的7300（96×0.2ml/4色）、7500 Fast（96×0.1ml/5色）、StepOne（48×0.1ml/3色）及StepOnePlus（96×0.1ml/4色）风头正盛。伯乐拥有MyiQ（96×0.2ml/单色）及iCycler iQ（96×0.2ml/4色），一看差点事，乘机并购了MJ Research公司，把DNA Engine Opticon 2（96×0.2ml/双色）和Chromo 4（96×0.2ml/4色）改换门庭后，又推出MiniOption（双色）、iQ5（96×0.2ml/5色）qPCR仪。罗氏先有LightCycler 1.5（32×20μl毛细管/3色）上市，后主推大众化的LightCycler 480 II（96×0.2ml或384孔板/6色）。同期Stratagene Mx3000P（96×0.2ml/4色）/Mx3005P（96×0.2ml/5色）因2007年美国并入Agilent而一息尚存。但eppendorf Mastercycler ep realplex2 (96×/0.2ml双色)、realplex4 (96×0.2ml/4色）则成为了历史。Qiagen死扛配置72×100μl、100×30μl离心式转头的Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪，前景堪忧。
表1 部分经典型号qPCR系统工作性能参数表
品牌
型号 ABI 7300 ABI 7500 Fast MJ Research
DNA Engine Opticon 2 Bio-Rad
iQ5 Roche
LightCycler 480 II
上市时间 2004年 2005年 2002年 2005年 2008年
模块升温速率 1.6℃/s 5.5℃/s 3.0℃/s 96×0.2ml模块:升3.3℃/s，降2.2℃/s;
双48×0.2ml模块:升2.2℃/s，降1.8℃/s;
384孔模块:升2.0℃/s，降1.8℃/s; 4.8℃/s
样品升温速度 1.1℃/s - - - 3.3℃/s
模块温控精度 ±0.25℃ of setpoint ±0.25℃ of setpoint ±0.3℃ of setpoint ±0.3℃ of setpoint ±0.2℃ of setpoint
模块温度均一性 ±0.50℃ ±0.50℃ ±0.4℃ ±0.4℃ ±0.2℃
常规应用中，qPCR仪工作时程是由PCR程序运行进度决定的。样品温度在变性、退火和延伸三个温度台阶转换的快慢完全取决于模块变温速度。同一个模板、相同组分体系，反应模块热升降温速度不同，执行同一PCR程序耗时大不相同。尤其是变性-退火转换步骤，温差高达35-40℃，不同热循环模块温度切变耗时悬殊。
以Veriti PCR仪主板预置的“常规PCR扩增程序”为例：94℃预变性1min→95℃变性15s+55℃退火15s+72℃延伸30s共35个循环→最后72℃延伸7分钟结束反应→4℃保温。每个循环中样品处于有效工作温度时长仅1分钟，但须经历一次94℃→55℃相对较慢的降温过程和一次55℃→72℃相对快速的升温过程。
 
如果把55℃→72℃进程喻为田径百米决赛，则94℃→55℃转换过程就相当于20公里竞走。东京奥运会苏炳添成绩9.98s排名第六，但与冠军成绩仅区区0.18s之差。竞走决赛中，选手王凯华排名第七但要比夺冠成绩落后了228s。选手速度实力差距放到拉长的赛程后，就变得显而易见。不同考查机型在进行PCR循环中这一升一降两个动作耗时差距道理亦是如此。
qPCR仪用户指南通常标明了仪器安装运行的海拔高度、环境温度、湿度、通风条件参考范围。而热循环模块降温速度除了环境条件还受所加载样品体积的制约。每个型号实时定量PCR仪实际降温速度，除了具体现场测试别无他法。我们讨论模块变温速度，其实是基于“模块升温速度快，散热效率理应较高”的假设和经验估算而已，并无真凭实据。
弱以实时荧光定量PCR仪额定变温速率估算PCR循环的升降温过程，将得到表2的结果。
表2 PCR循环变温过程时长估算数据表
qPCR仪型号 7500 QuantStudio 1 CFX connect QuantStudio 5 CFX opus 96
模块升温速度 2.5℃/s 3.5℃/s 5.0℃/s 6.5℃/s 5.0℃/s
变温测算标准 样品升温1℃/s
样品冷却 1.5℃/s 样品变温均速1.88℃/s 模块变温均速3.3℃/s 样品变温最大速度3.66℃/s 模块变温均速3.3℃/s
95→55℃过程 27s 22s 13s 11s 13s
55→72℃过程 17s 9s 6s 5s 6s
循环变温耗时 44s 31s 19-30s 16-30s 19-30s
结果显示，不同代差qPCR系统升温过程中耗时差别可达2倍。但最大升温速度5℃/s-6.5℃/s的机型间比较，升温过程时长区别不大。
仪器标称Peak Ramp Rate，是热循环模块按默认最高变温速度模式运行时瞬时速度极限，与实际稳定运行升温速度（以2-4℃居多）有相当差距。因此，有人认为，品牌PCR仪热循环模块实际变温速度差并不大，以每个循环时差20秒、35个循环计算，时差不过12分钟，完全可以忽略。其实这种论点不妥，原因有二。
一是不完全符合事实。模块工艺技术代差相同的PCR仪，如GeneAmp 2720和伯乐Mycyler，二者完成相同protocol时长固然接近。但模块变温性能差距拉大到一定程度后，如2720 VS SimpliAmp PCR仪，恐怕2720的慢条斯理的节奏难免遭到吐槽。这一点，eppendorf官方实测报告可以佐证。
 
其二论据存在疏漏。人们只盯着升温速度，却忽略了94℃→55℃过程降温速度这个关键瓶颈因素。PCR循环相当部分时间其实就浪费在这一步。
若降温速度以2.0℃/s估算，图中的程序降温时长差不多是升温耗时的3-4倍。7500和QuantStudio 1两款机型降温速率相差仅0.4℃/s，但前者耗时近30秒，后者为20s左右，完成单次循环二者耗时相差超过10秒。可见，在PCR热循环中，降温速度的微小差异会在实际运行中被数倍放大，从而明显拉大不同qPCR系统任务完成时差。伯乐Mycycler PCR仪（最快升温速度2.5℃/秒）完成35个循环扩增，耗时据称超过2个半小时。当今主流96×0.2mL标准模块SimpliAmp PCR仪及QuantStudio 3 qPCR仪，完成35个标准曲线定量实验流程，运行时长不会超过2小时。
同种反应模块配置，快速变温能力，意味着实验、运行管理效率更高，可接待更多人次的机器使用预约。
二、样品模块变温速度影响PCR产物特异性
在PCR仪服务工作中，屡屡听到科研人员反映：同一个片段，用某品牌PCR仪可以有效扩增，换个品牌机器扩增会失败。虽然所言具体细节难以确认，但其实这反映的是PCR和qPCR实验结果可重复性的问题。
热循环模块升降温速度对PCR产物特异性有影响，这在业内是有共识的。
Eppendorf的资料说明，PCR样品在变性-退火-延伸三个步骤间的升降温速率属性，影响PCR 结果可重复性。PCR反应模块温控速率的变化，会使PCR产物凝胶电泳带型改变。这在随机扩增多态性DNA 分析（RAPD）实验中表现尤为显著。此外。变温速率的不稳定对PCR实验结果的危害，类似于模块控温误差带来的干扰。
短串联重复序列(STR) 在基因组中的重复数量在个体间呈高度多态性。采用PCR仪扩增STR的检测分析是物种系统发育、司法物证与民事亲子鉴定等领域的重要手段。耶拿公司人士认为，高速PCR扩增STR具有特异性好的巨大优势。
说明，不仅是PCR热循环模块温度控制精确性和均一性，升降温速度控制也影响qPCR实验结果的稳定。
众所周知，温度准确有效是PCR反应的灵魂。表1也显示，20年来，PCR模块温度控制的均一性从±0.50℃提到±0.2℃，温控精度一直保持在±0.2-0.3℃。提高反应模块的温度控制精度和内部温度均一性，确保PCR反应组分尽可能处于设定的有利温度而非偏离设定温度，可提升PCR扩增效率，减少错误和非特异性反应。
热循环模块升降温速度影响PCR反应特异性的原因在于，PCR模块的快速变温，使热循环步骤中温度转换过程时间占比大幅缩短。反应体系处于中间过渡温度环境的时间极大压缩，而保持在实验“有效温度”的时间比例大幅增加。这相当于提升了模块保持有效设定温度时间的能力。
72-95℃高温停留时间越长，PCR反应体系蒸发进入管内死腔水份越多，体系浓缩越严重，会使PCR扩增效率下降。而55-72℃阶段，引物具有一定程度同源的核酸片段的复性延伸，争夺体系中Taq酶和合成原料资源，对模板扩增构成竞争抑制效应。反之，循环过程温度偏离设定点少，扩增失误少，必然有助于提高扩增产物产量并减少异常温度条件下引起的非特异结合。PCR可靠性增高，实验结果可重复性改善则顺理成章。
qPCR仪诞生20多年来，当提升模块温控精度和温度均一性潜能掘尽后，改进模块工艺材料和温度控制元件性能，大幅加快热循环模块升降温速度，成为实时荧光定量PCR仪发展史上具有里程碑意义的进步。
目前主流qPCR仪，如伯乐最新上市的CFX Opus 96系统，其96-Well Fast模块最大升降温速率为5℃/s（平均升降温速率3.3℃/s）。赛默飞QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪的96×0.2mL模块最高升温速率可达6.5℃/s，而96×0.1mL模块这一指标已跃升至9.0℃/s。
罗氏LightCycler 2.0的毛细管离心式反应模块，升温速度更是高达20℃。其初衷就在于尽可能减少温度过渡时间，从而把样品体系锁定在设定温度上，确保PCR检测性能。三、qPCR仪快速升降温能力让快速PCR功能如虎添翼
一般认为，快速PCR仪/qPCR仪意指PCR模块具有快速变温能力（通常升温速度不低于5.0℃/s），比普通PCR反应模块可有效缩短反应时间。业内将升温速度达到4℃配置0.1mL模块的qPCR仪冠名为快速实时荧光定量PCR仪，以区别于标准0.2ml模块机型。
而快速PCR功能是指PCR热循环过程采用快速反应模式。核心是qPCR仪系统预置快速反应功能模式，并不局限于具备超快升降温速度模块。赛默飞StepOnePlus实时荧光定量PCR仪，就有标准模式和快速反应模式，虽然其最高升温速度仅4.6℃/s。同样的，7500 Fast（升降温速率5.5℃/s）也支持快速模式和标准模式两种运行程序。快速运行功能模式，可在40分钟内完成标准模式下近2小时的扩增任务。
通常，要实现快速PCR反应，必须三管齐下。
一是用薄壁0.1mL PCR管或PCR板(如伯乐low-profile耗材)和专用0.1mL Fast反应模块。模块升降温迅速是基础，而壁薄导热迅速，加之反应体积小，升降温变得更敏捷；
二是压缩热循环各步骤的保持时间，这是有效且立竿见影的举措。譬如根据模板片段长度，将退火15s缩短为5-10s，延伸时间由30s缩短至10-15s。如果引物的退火和延伸温度相差无几，则可将它们合并，这样变标准PCR程序变性96℃、56℃退火、72℃延伸三步为95℃变性、72℃延伸两步后，可进一步缩短PCR运行时间。
三是采用高扩增能力DNA聚合酶，这是实现快速PCR和PCR扩增稳产高产的关键。高合成能力 Taq 聚合酶所需的延伸时间仅需常规Taq聚合酶1/3-1/2的时间，即可维持较高扩增效率。
可见，qPCR仪的快速升降温能力与快速PCR功能模式，相互独立又能相互协同，珠联璧合，有助于实现快速高效PCR分析检测。四、实时荧光定量PCR仪升降温速度性能的意义
在明确qPCR仪热循环模块升降温速度对实验结果稳定性的提质、和对实验管理效率增效的作用后，速度快、精度高、均一性好就可作为实时定量PCR仪选型的重要策略。
当升降温速度接近时，0.2ml标准反应模块的实时荧光定量PCR仪既有快速变温优势，又能照顾多数人的实验习惯，无疑非常稳妥。而0.1ml快速反应模块具有支持10～30ul小体积、反应管内蒸发死腔小、壁薄热导效率高、样品升降温效能高特定，在满足检测限度要求情况下，工作效能无疑要更高。
如果要为实验平台用的实时荧光定量PCR仪划一个控温性能指标，升温速度达到多少才算“先进、够用”？我们不妨看看在国外高IF刊文中牛人用的是何种性能档次的qPCR系统。
表3 2019至2021 qPCR实验仪器型号与发文数量表
品牌型号 ABI 7300 ABI 7500 ABI 7500 Fast ABI StepOne Plus ABI
ViiA 7 ABI QuantiStudio系列 Bio-Rad
CFX96 系列 Roche
LightCycler 480 II
上市年份 2004 2004 2005 2007 2010 2013/2018 2018/2018 2008
升温速度 1.6℃/s 2.5℃/s 5.5℃/s 4.6℃/s 5.5℃/s 3.5-6.5℃/s 5.0℃/s 4.8℃/s
检索词  7300 Real-Time PCR 7500 Real-Time PCR 7500 Fast Real-Time PCR StepOne Plus ViiA7 + PCR QuantiStudio CFX96 Touch、
CFX96 Real-Time PCR LightCycler 480 II
发文数量 1239篇 4269篇 2959篇 61篇 1190篇 39篇 2518篇 974篇
备注 检索选项:[Text Word]
检索时间跨度："2019/01/01"[PubDate] : "2021/08/01"[PubDate]
（数据来源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）
表3显示，论文中使用最多的是7500型，其次是7500 Fast、CFX96、7300、ViiA7、LightCycler 480 II、StepOne Plus和QuantiStudio系列机型。上市较早、升温速度2.5℃/s的7500竟远超同期上市、升温速度更快7500 Fast、LightCycler 480 II及后起之秀ViiA7和伯乐CFX96型实时荧光定量PCR仪。
表4 高影响因子发文作者单位举例
品牌机型 发文单位/期刊名称
ABI 7300 J. Exp. Med. (2021)
Cornell University College of Veterinary Medicine Cell Death and Disease(2021)
Huashan Hospital, Fudan University Stem Cell Research & Therapy(2021)
Chinese PLA General Hospital & Tsinghua University, Shenzhen Nat Commun(2021)
School of Basic Medical Sciences, Shandong University eLife(2021)
University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh
ABI 7500 Cell Death and Disease(2021)
Zhongshan Hospital Qingpu Branch,Fudan University Cell Death and Disease(2021)
Fudan University Cell Death and Disease(2021)
Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine J Exp Med.(2021)
Cornell University College of Veterinary Medicine Cell Death and Disease(2021)
Soochow University
（数据来源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）
在IF 8.0以上期刊众多文章中，既有不差钱的美国研究机构，也有诸如复旦大学及附属医院、上海交大附属医院、清华深圳研究院、山东大学、苏州大学等科研条件较好的国内院校。在国内外学术达人手中，面世已16年的7300和7500两款老qPCR仪，依旧熠熠生辉。使用了其检测数据的研究结果被荣幸刊发在J. Exp. Med.、Nat Commun这类Top级牛刊上。
话说回来，调研证实，升温速度快的7500Fast、7500实时荧光定量PCR仪发文用户，显然比7300的用户多得多。说明更高更快的运行体验更受科研人员待见，这是事实。
就小型实验室qPCR仪而言，对比QuantiStudio 1(最高升温速率3.5℃/s，三检测通道)和CFX Concet(最高升温速率5.0℃/s，平均升降温速率 3.3℃/s，三检测通道)，CFX Concet变温速度更高，实验效能更高。参考文献
Stephen A. Bustin, Vladimir Benes, Jeremy A. Garson, et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.Clinical Chemistry,2009 Apr;55(4):611-22
吴潇韫,王忠华.德国耶‍‍‍应用驱动型qPCR仪选型攻略-1

二、样品模块变温速度影响PCR产物特异性

       在PCR仪服务工作中，屡屡听到科研人员反映：同一个片段，用某品牌PCR仪可以有效扩增，换个品牌机器扩增会失败。虽然所言具体细节难以确认，但其实这反映的是PCR和qPCR实验结果可重复性的问题。

       热循环模块升降温速度对PCR产物特异性有影响，这在业内是有共识的。

       Eppendorf的资料说明，PCR样品在变性-退火-延伸三个步骤间的升降温速率属性，影响PCR 结果可重复性。PCR反应模块温控速率的变化，会使PCR产物凝胶电泳带型改变。这在随机扩增多态性DNA 分析（RAPD）实验中表现尤为显著。此外。变温速率的不稳定对PCR实验结果的危害，类似于模块控温误差带来的干扰。

       短串联重复序列(STR) 在基因组中的重复数量在个体间呈高度多态性。采用PCR仪扩增STR的检测分析是物种系统发育、司法物证与民事亲子鉴定等领域的重要手段。耶拿公司人士认为，高速PCR扩增STR具有特异性好的巨大优势。

       说明，不仅是PCR热循环模块温度控制精确性和均一性，升降温速度控制也影响qPCR实验结果的稳定。

       众所周知，温度准确有效是PCR反应的灵魂。表1也显示，20年来，PCR模块温度控制的均一性从±0.50℃提到±0.2℃，温控精度一直保持在±0.2-0.3℃。提高反应模块的温度控制精度和内部温度均一性，确保PCR反应组分尽可能处于设定的有利温度而非偏离设定温度，可提升PCR扩增效率，减少错误和非特异性反应。

       热循环模块升降温速度影响PCR反应特异性的原因在于，PCR模块的快速变温，使热循环步骤中温度转换过程时间占比大幅缩短。反应体系处于中间过渡温度环境的时间极大压缩，而保持在实验“有效温度”的时间比例大幅增加。这相当于提升了模块保持有效设定温度时间的能力。

       72-95℃高温停留时间越长，PCR反应体系蒸发进入管内死腔水份越多，体系浓缩越严重，会使PCR扩增效率下降。而55-72℃阶段，引物具有一定程度同源的核酸片段的复性延伸，争夺体系中Taq酶和合成原料资源，对模板扩增构成竞争抑制效应。反之，循环过程温度偏离设定点少，扩增失误少，必然有助于提高扩增产物产量并减少异常温度条件下引起的非特异结合。PCR可靠性增高，实验结果可重复性改善则顺理成章。

       qPCR仪诞生20多年来，当提升模块温控精度和温度均一性潜能掘尽后，改进模块工艺材料和温度控制元件性能，大幅加快热循环模块升降温速度，成为实时荧光定量PCR仪发展史上具有里程碑意义的进步。

       目前主流qPCR仪，如伯乐新上市的CFX Duet、CFX Opus 96系统，其96孔反应模块最大升降温速率为5℃/秒（平均升降温速率3.3℃/秒）。Applied Biosystems QuantStudio 5、QuantStudio 6 Pro/ 6 Flex和QuantStudio 7 Pro/7Flex系列的标准96×0.2mL模块，最高升温速率达到6.5℃/秒，而96×0.1mL模块的这一指标更是跃升至9.0℃/秒。

       罗氏LightCycler 2.0的毛细管离心式反应模块，升温速度更是高达20℃。其初衷就在于尽可能减少温度过渡时间，从而把样品体系锁定在设定温度上，确保PCR检测性能。 

三、qPCR仪快速升降温能力让快速PCR功能如虎添翼

       一般认为，快速PCR仪/qPCR仪意指PCR模块具有快速变温能力（通常升温速度不低于5.0℃/s），比普通PCR反应模块可有效缩短反应时间。业内将升温速度达到4℃配置0.1mL模块的qPCR仪冠名为快速实时荧光定量PCR仪，以区别于标准0.2ml模块机型。

       而快速PCR功能是指PCR热循环过程采用快速反应模式。核心是qPCR仪系统预置快速反应功能模式，并不局限于具备超快升降温速度模块。赛默飞StepOne Plus实时荧光定量PCR仪，就有标准模式和快速反应模式，虽然其最高升温速度仅4.6℃/s。同样的，7500 Fast（升降温速率5.5℃/s）也支持快速模式和标准模式两种运行程序。快速运行功能模式，可在40分钟内完成标准模式下近2小时的扩增任务。

       通常，要实现快速PCR反应，必须三管齐下。

       一是用薄壁0.1mL PCR管或PCR板(如伯乐low-profile耗材)和专用0.1mL Fast反应模块。模块升降温迅速是基础，而壁薄导热迅速，加之反应体积小，升降温变得更敏捷；

       二是压缩热循环各步骤的保持时间，这是有效且立竿见影的举措。譬如根据模板片段长度，将退火15s缩短为5-10s，延伸时间由30s缩短至10-15s。如果引物的退火和延伸温度相差无几，则可将它们合并，这样变标准PCR程序变性96℃、56℃退火、72℃延伸三步为95℃变性、72℃延伸两步后，可进一步缩短PCR运行时间。

       三是采用高扩增能力DNA聚合酶，这是实现快速PCR和PCR扩增稳产高产的关键。高合成能力 Taq 聚合酶所需的延伸时间仅需常规Taq聚合酶1/3-1/2的时间，即可维持较高扩增效率。

       可见，qPCR仪的快速升降温能力与快速PCR功能模式，相互独立又能相互协同，珠联璧合，有助于实现快速高效PCR分析检测。 

四、升降温速度性能对实时荧光定量PCR仪选型的指导意义

       在明确qPCR仪热循环模块升降温速度对实验结果稳定性的提质、和对实验管理效率增效的作用后，速度快、精度高、均一性好就可作为实时定量PCR仪选型的重要策略。

       当升降温速度接近时，0.2ml标准反应模块的实时荧光定量PCR仪既有快速变温优势，又能照顾多数人的实验习惯，无疑非常稳妥。而0.1ml快速反应模块具有支持10～30ul小体积、反应管内蒸发死腔小、壁薄热导效率高、样品升降温效能高特定，在满足检测限度要求情况下，工作效能无疑要更高。

       如果要为实验平台用的实时荧光定量PCR仪划一个控温性能指标，升温速度达到多少才算“先进、够用”？我们不妨看看在国外高IF刊文中牛人用的是何种性能档次的qPCR系统。

表3 2019至2021 qPCR实验仪器型号与发文数量表

（数据来源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）

       表3显示，论文中使用最多的是7500型，其次是7500 Fast、CFX96、7300、ViiA7、LightCycler 480 II、StepOne Plus和QuantiStudio系列机型。上市较早、升温速度2.5℃/s的7500竟远超同期上市、升温速度更快7500 Fast、LightCycler 480 II及后起之秀ViiA7和伯乐CFX96型实时荧光定量PCR仪。

表4 高影响因子期刊发文作者单位举例

（数据来源于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）

       在IF 8.0以上期刊众多文章中，既有不差钱的美国研究机构，也有诸如复旦大学及附属医院、上海交大附属医院、清华深圳研究院、山东大学、苏州大学等科研条件较好的国内院校。在国内外学术达人手中，面世已16年的7300和7500两款老qPCR仪仍是熠熠生辉，检测结果依旧深受这般牛人、牛刊的信赖。

       不过，话说回来，调研证实，升温速度快的7500Fast、7500实时荧光定量PCR仪发文用户，显然比7300的用户多得多。说明更高更快的运行体验更受科研人员待见是无疑的。

       就小型实验室qPCR仪而言，对比QuantiStudio 1(最高升温速率3.5℃/s，三检测通道)CFX Duet最（高升温速率5.0℃/s，平均升降温速率 3.3℃/s，三检测通道)，显而易见，后者变温速度更高，当然是实验效能更高。 

参考文献

［1］Stephen A. Bustin, Vladimir Benes, Jeremy A. Garson, et al. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.Clinical Chemistry,2009 Apr;55(4):611-22

［2］吴潇韫,王忠华.德国耶拿高速PCR之典范SpeedCycler 2