没有Nano微量紫外可见光度计qPCR核酸浓度纯度怎么测？

       关于核酸浓度纯度测定具体指标的问题，《MIQE指南对qPCR实验中核酸紫外测定的要求-下》已有专门讨论，即核酸纯度评估应采用A260/A280、A260/A230双比值法，核酸浓度测定用A260指标即可，核酸样品的浓度、纯度测定不可偏废。

       主流微量紫外可见光度计的核酸测定应用程序，所建立的标准化的测试和报告体系，通常都具备以下功能特征：

        1）若是用非标准比色皿光程进行的吸光度检测，系统会按先长（光程）后短（光程）的次序自动进行多光程的吸光度测定，自动选择最佳测试光程（介于1.0mm和0.03mm之间）下读数作为计算依据。软件自动将测定初始值归一化为10mm光程的当量值，用于计算核酸浓度、A260/A230和A260/A280比率；

        2）双链DNA（dsDNA）、单链DNA（ssDNA）或RNA样品测定完成，系统默认报告核酸浓度、两个吸光度比值（A260/A280和A260/A230）和吸光度-浓度换算系数；

        3）核酸浓度以选中的单位（即ng/μL、μg/μL或μg/mL）报告。计算公式为：

                                         c=A·f

其中：

A：归一化为10mm光程的吸光度，以吸光度单位(A)表示；

F：吸光度-核酸浓度计算系数的单位为ng-cm/μL。双链DNA系数为50 ng-cm/μL；单链DNA系数为33 ng-cm/μL；RNA系数为40 ng-cm/μL；

C：浓度单位为ng/μL。

       以NanoDrop One、NanoDrop OneC微量紫外可见光度计的dsDNA测定为例，测定结果报告自动给出浓度（单位ng/μL）、A260/A280计算值、A260/A230计算值、A260和A280测定值。                                              

       NanoDrop One dsDNA样品测试结果的报告界面还标注了结果计算中采用了340nm 基线矫正（Baseline Correction）算法。正常情况下，纯化的核酸样品吸收波长扫描曲线，存在一峰（260nm吸收峰）、一谷（230nm吸收低谷）和一平（340nm波长开始光吸收降低到0，与检测器背景信号基线近乎平行）。但因不同测试溶液条件和检测器自身背景信号，样品吸光度值可能存在偏差。所谓基线矫正，是指系统从样品所有波长的吸光度值（如核酸的A260、A280和A230原始测定值）减去指定基线矫正波长的吸光度值（如核酸常用的A340），对测试值进行修正。

       Implen NanoPhotometer NP80、N60、N50微量紫外光度计的DNA测定结果报告中，系统给出了测定物质和测定方法、ng/μL浓度、消光系数、A260/A280值、A260/A230值、A230 、A260和A280测定值，并对存在异常的测定值予以警示标志。

       资料显示，国产的Nano 100、Nano 300微量紫外可见光度计的核酸样品测试结果报告中，所列事项与前述两款进口机型此基本一致。

       NanoVolume类微量紫外可见光度计，无论是NanoDrop One、NanoDrop Eight、NanoPhotometerNP80/N60/N50、Nano300等全波长扫描功能的标准机型，还是NanoDrop Lite Plus和Nano 400这类检测光源为230nm、260nm、280nm固定波长的精简版型号，系统预置测定协议生成的测试报告事项，完全符合MIQE指南所规定的核酸质量评估控制要求。这样，省去繁琐的参数设定和测定数据手工计算，极大方便了核酸样品质量的测评工作。

       如无现成的NanoVolume紫外测定工具，如何利用普通紫外可见分光光度计进行核酸纯度浓度测定？

       最经济易行的解决方案是eppendorf的UVette比色皿。

       UVette比色皿同时具有两种光程长度 ，将UVette 旋转 90°可在10 mm 和2 mm两种光程间切换。对于PCR、反转录和实时荧光定量PCR实验，样品经适度稀释后，参考50μL的加样量和采用2mm光程进行测定，或许有助于解决微量样品测定中的基本难题。

       UVette比色皿具有较好的兼容性。在标准测试光束高度8.5mm的分光光度计中，可以直接使用UVette比色皿，其操作方法即与常规比色皿测试操作一致。针对测试光束距离检测池底部的高度为10mm、15mm的光度计，添加eppendorf提供相应比色皿适配器，将适配器-比色皿组合叠加固定后，安装到标准光程检测池内测试即可正常使用。

        通常，综合应用型紫外光度计仪器检测参数设置比较繁琐。它要求操作者对测试方法体系了然于胸，同时还要熟悉仪器本身设置方法和设定选项的涵义。

       以日立UH5300的核酸测定应用为例。系统提供了核酸样品测量功能模块，可用于核酸样品230 nm，260 nm，280 nm和320 nm四个测试波长吸光度测定，并根据测量吸光度和吸光度比（A260 / A280，A260 / A230）计算核酸的纯度，浓度等。

       开机后需完成如下步骤设置：

测量条件设置(Measurement Conditions)

样品条件设置(Setting Sample Conditions)

测量条件设置(Setting Measurement Conditions)

核酸浓度条件设置(Setting Nucleic Acid Concentration Conditions)

检测池6个比色皿样品的设置（Setting 6 Cells)

对照项设置 (Setting Control Items)

打印条件设置 (Setting Printing Conditions)

保存条件设置 (Setting Condition Saving)

测量样品溶液设置(Measuring Sample Solution)

保存和打印数据设置(Saving and Printing Data)

       庆幸的是，测定参数中的核酸浓度计算因子、核酸浓度单位、核酸纯度、核酸纯度比值标准等关键设置，程序都预置有可选项，无须手工输入。从工作界面上看，与NanoDrop One、NanoPhotometer N60 和Nano 300等生物学专用微量紫外可见光度计比，UH5300的应用程序中并未将核酸具体类型细分，Expected Ration、Nucleic Acid Conc factor与核酸类型间的对应关系，实验者必须十分熟悉且准确无误才行。

参考文献
NanoDrop One Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Rev. E)
NanoPhotometer N120/NP80/N60/N50/C40 User Manual (Version 4.3.4)
Nano-300 微量分光光度计操作手册(Version 2.0)
Eppendorf UVette Universal Adapter Use Instructions
Model Uh5300 Spectrophotometer Instruction Manual