什么是荧光显微镜中的光漂白及减少光漂白的方法

光致漂白是荧光团由于光引起的破坏而失去荧光的现象。这导致在对样品成像时荧光和信号的损失。

当适当波长的光入射到荧光团上时，它会从基态跃迁到激发的单重态和三重态阶段。在其激发态下，它可能与其他分子相互作用并经历永久性共价修饰。

而且，与单重态相比，三重态的寿命更长，这使其更易于与其他分子相互作用。每个荧光分子在激发和发射之间的这些循环总数取决于其结构和周围的局部环境。 

基于这些参数，某些荧光团可以快速漂白，而另一些荧光团可以在漂白之前经历数千次激发和发射循环。

减少光漂白的方法

降低光强度

降低光的强度可以减少荧光团对光的暴露，从而减少其经历的激发发射循环。这最终减少了与其相关的光致漂白。但是，降低光强度也会降低信号强度。因此，应在实现正确的信号强度和最小化光漂白之间取得正确的平衡。

减少曝光时间

这是降低光漂白效果的另一种方法。在这种情况下，减少曝光时间将减少荧光团经历激发-发射循环的次数，从而减少光致漂白。这可以通过减少激光的像素停留时间或固定更快的成像帧/秒速率来实现。

另一种方法是限制成像区域。这可以通过固定一个较小的目标区域并在对该区域成像后继续移动到相邻区域来实现。

添加防褪色剂

防褪色剂是可以降低光漂白效果的试剂。这些是封固剂，在免疫组化的所有步骤之后，在成像前的最后一步中使用。

使用其他染料

不同的染料或荧光团具有不同的光漂白性能。例如，与绿色荧光蛋白相比，红色荧光蛋白更容易发生光漂白。因此，改变选择的染料并使用一种更耐光的染料也可以用来减少样品的光漂白。

使用中性密度滤镜

使用中性密度滤光片还可以减少入射到样品上的光或光子数。这也可以减少样品对光的暴露并减少光致漂白。同样，这也可以降低样品的信号。

解决此问题的一种方法是增加光电倍增器的增益功能。但是，增加此功能也会增加噪声以及图像信号。因此，应在信噪比和光漂白之间达到适当的平衡，以获得最佳图像。

光漂白的用途

当样品包含由于内源性荧光团而自然发出荧光的细胞物体时，自发荧光是一种现象。这些组织或细胞器通常以与常用荧光团相似的波长发出荧光，例如绿色荧光蛋白（GFP）或异硫氰酸荧光素（FITC）。这增加了在区分实际信号和来自内源荧光团的信号时的误差。在这种情况下，可以将光漂白用作工具。可以将图像暴露在紫外线下两个小时，以漂白内源性荧光团，然后用适当的光特异性荧光蛋白（例如GFP）对样品进行成像，以降低自发荧光作用。