用于研究的现代光学显微镜的光学对比方法及对生物学研究的巨大影响

光学对比法使人们有可能借助生物显微镜轻松检查活的和无色的标本。不同的显微技术旨在将由光与样品的相互作用引起的相移改变为振幅变化，人眼可以看到振幅变化。

明场显微镜通常只能提供未染色标本的较弱图像，其中只有少量细节可以检测到。强烈的对比度对于查看图片中的更多细节很重要。增强对比度的一种方法是对样品染色。但是，由于这对于活生物体来说是不可能的，因此它们保持不变色并且显得不起眼。这些样本实际上也在光学显微镜中与入射光相互作用。然而，发生了人眼无法检测到的相移。眼睛只能感觉到振幅（亮度）和频率（颜色）的变化。

 对比度是指区分样本和背景并发现样本中细节的可能性。定义为图像与相邻背景之间的光强度与总背景强度的差。对于人眼，这些差异必须至少为百分之二才能被检测到。使用光电探测器可以实现巨大的改进。

 但是，对比度不仅取决于样品及其与光本身的相互作用。用于观察标本的光学系统及其记录图像信息的能力也很关键。在显微系统中，对比度取决于正确的光圈设置，光学像差的等级，所使用的对比度方法，样本和检测器。

 因此，通过改变光圈的光圈设置，可以独立于对比度方法而影响用光学显微镜获取的图像的对比度。但是，例如如果聚光镜停止得太远，则分辨率会受损，并且可能会出现衍射伪像。

 获得足够对比度的最古老方法可能是先对样品染色。通常，这仅适用于死物质，并偶尔需要一些复杂的染色方案。如果要观察活细胞，则不容易染色。因此，由适当的光学显微镜提供的不同技术旨在将由光与样本的相互作用引起的相移改变为幅度偏移。

 相位对比和微分干涉对比（DIC）是这些对比方法的示例。其他光学对比方法是暗场和偏振对比。

兔子味蕾断面，相差显微镜

兔子味蕾断面，微分干涉对比显微镜

兔子味蕾断面，明场显微镜

光线与标本之间的相互作用

如果入射光照射到标本上，它们将相互作用。吸收，反射，衍射，光散射和折射都是可能的后果。在此过程中，醒目的光波发生了变化。相移以及幅度变化都是可能的。

 在这一方面，可以区分相位和幅度对象。理想地描述，相位对象是改变相位但不改变光波幅度的样本。相反，振幅对象仅影响光的振幅，而不影响光的相位。扁平且未染色的细胞几乎达到了可见光相位对象的特性。由于它们仅导致人眼无法看到的相移，因此它们在明场显微镜下的对比度非常低。振幅对象本身可以在明场显微镜中很好地成像。它们降低了振幅，从而降低了穿过的光的强度。

 染色或自然着色的物体可以在明亮的视野中很好地显示。它们属于振幅对象。它们减少了通过的光，因此减小了波前的幅度。但是它们不是理想的振幅对象。除了振幅外，它们还影响照射光的成分。它们吸收或反射具有不同频率的波，而其他波长的光可以不受阻碍地穿过。

 由于样品和周围介质的折射率不同，会发生相移。如果光波进入单元，它将被准减速，而振幅将保持不变。当光离开细胞时，它恢复速度并以与以前相同的频率，波长和幅度穿过介质。然而，与仅穿过介质的光相比，其相位已经发生了变化。

 鉴于人眼和其他光学检测器无法识别和检测光波的相移，在未染色和未着色样品的情况下，对比方法的主要目的是产生振幅对比并将相位对比转换为幅度对比。

对生物学研究的巨大影响

与使用固定和沾染的物体相比，使用未染色的标本具有许多优势。它允许在没有固定物和染色伪影的生物显微镜下观察活体。固定和染色会例如使样品收缩或膨胀。此外，存在破坏细胞中不同结构或实质上改变其形态的风险。消除这种危险的唯一肯定的方法是使用没有伪影并提供可靠和真实信息的活体样品。活细胞显微镜检查的另一个巨大优势是可以检查与时间有关的情况。除了获得细胞的静态信息及其状况的快照之外，还可以轻松监控整个过程，例如细胞运动，细胞分裂以及细胞凋亡。

 从不同的光学对比方法获得的信息和印象取决于其来源。因此，建议依靠不同对比技术的组合来获得所检查样本的最准确和最详细的图像。尽管明场通常无法准确观察细胞的形态，但其他光学对比方法可能会提供进一步的见解。

 通过将荧光标记添加到细胞的实时图像中可以获得更多信息。可以用荧光蛋白（如GFP）标记细胞中感兴趣的蛋白。然后可以通过光学显微图像追踪并精确确定其在细胞内部的定位。也存在将GFP与肽定位信号偶联的可能性。这样，可以看到像内质网这样的不同隔室。

 用于研究的现代光学显微镜通常采用模块化设计，从而可以在各个对比方法之间或什至同时应用时快速切换。光学对比方法使人们有可能在日常的实验室常规操作中轻松检查活的和无色的标本。