如何有效评价凝胶成像分析仪的技术性能-光学镜头

悟凝胶成像系统性能为图像分析开新局-2

凝胶成像分析仪的CCD/CMOS传感器，尺寸以1/2、3/4和1英寸多见。这里的尺寸是指CCD感光靶面的对角线长度。但与电脑和手机屏幕尺寸用的单位英寸(inch)不同，CCD行业换算标准为1英寸为16mm而非25.4mm。常用的3/4英寸CCD对角线折合约12mm，外观大小跟手指甲盖面积相仿。

无论Wide Mini-Sub GT宽式水平电泳槽 灌制的7×7cm核酸凝胶，或伯乐Mini-Protean Tetra蛋白垂直电泳槽用的10.1×7.3cm小型SDS-PAGE蛋白凝胶，尺寸都远超传感器感光面有效尺寸。更不用说凝胶成像分析仪可容纳1-4块7×7cm或7×10cm小型凝胶同时成像，成像区域宽20-26 cm×纵深14-22cm，物像尺寸比高达30-40倍。

孙悟空凭神乎其技的缩骨换形本事，才能钻进铁扇公主的肚子里完成“说走就走的旅行“。CCD要采集完整样品区图像，得靠光学镜头高效收集、汇聚来自拍摄对象的光线，形成清晰的缩小实像并精准投射在感光靶面上，才居高临下“一览众山小“。

光学镜头不仅对CCD成像效果发挥基础决定作用，还对凝胶成像分析仪的机箱内部空间高度有密切关系。

1、镜头的明眸善睐-光圈系数

数值孔径是衡量光学镜头能收集光的角度范围的指标，等于透镜与被检物体间介质折射率（n）和孔径角（2θ）半数的正弦之积，即：NA = n × sinθ。

孔径角是透镜光轴上的物点与透镜有效孔径直径(DEP)形成的夹角。孔径角越大，镜头的光通量就越大。凝胶成像系统中，镜头数值孔径NA =sinθ。如图所示，NA与有效孔径直径(DEP) 或通光孔径D成正比，与焦距成反比。

在摄影行业，通常都是用“光圈系数”（f-Stops/f-系数）” 表示镜头的通光能力大小。光圈系数f/#与NA为反比关系，即 NA=1/[2(f/#)]。f/#越小，则NA越大。

在镜头上标记的数值f/1、f/1.4、f/2、f/2.8、f/4、f/5.6、f/8等，正是镜头的最大光圈系数f/#。镜头f/#越小，代表镜头通光孔径越大，可采集到光线（通光量）越多，更容易发现弱信号样品。

目前，普通凝胶成像仪用的镜头为f/1.2、f/0.95，而同时具有Western Blot印迹膜ECL成像与凝胶成像功能的成像系统，为增强检测微弱信号检测能力，镜头光圈系数为f/0.95 、f/0.8甚至更低。如Invitrogen iBright CL1500荧光化学发光凝胶成像分析系统为f/0.95，ChemiScope 6200荧光及化学发光成像系统为f/0.8。而GE最新的Amersham ImageQuant 800多功能成像仪搭载是f/0.74定焦镜头。

光圈系数不仅限于控制光通量，还与光学分辨率有关。f/#值越低，对细微结构细节分辨和条带边缘轮廓细节呈现得越清晰。

考核和比较不同型号凝胶成像分析仪成像技术性能，可先从摄像镜头f/#值开始。

2、镜头的缩放自如-焦距

2.1镜头变焦 VS 定角

关于成像镜头焦距类型对曝光速度的影响问题，Alapha官方资料中提到：对Western/Slot Blot样品成像，FluorChem HD2 成像系统使用超级定焦镜头（Manual 50mm, f/0.95 fixed lens）来增加光信号收集速度，缩短成像时间；在化学发光检测中，用变焦镜头的系统往往需要更多曝光时间才能得到合适的图像。

这里提出2个论点，一是光学镜头有定焦镜头（fixed lens）和变焦镜头（zoom lens）之分，二是定焦镜头曝光速度高于变焦镜头。我们不妨展开来探讨一下。

定焦镜头只有一个固定焦距镜头，常规摄影中常用的有8mm，15mm，24mm，28mm，35mm，50mm等多种。所谓“对焦”和“调焦”，是指用镜筒上对焦环细微调整镜头与感光元件间成像距离，使拍摄成像清晰。

定焦镜头因为内部结构相对简单，镜头口径往可以做得更大，数值孔径NA增大（光圈系数较小）后，镜头光通量自然更大。“快镜头”光圈很大，指的正是定焦镜头。

变焦镜头是在一定范围内可以变换焦距的镜头，通常是由很多个定焦镜片排列组合而组成复杂结构，如28～200mm镜头就集广角、标准和中、长焦距为一体，包含了6-7个定焦镜头。可通过旋转镜头筒上的变焦环调节镜片内部之间距离，以保证不同远近对象都能形成清晰影像，复杂的内部结构制约了镜头总体数值孔径的提升，光通量提升空间极为有限。

由此，我们就容易理解所谓的定焦镜头“快”和“曝光时间短”的涵义了。

表1  凝胶成像系统镜头分辨率-焦距-成像区域指标对比

从表1，我们可更直观地看出定焦镜头和变焦镜头应用的区别。凝胶成像分析仪用的是光圈系数f/1.2的8-48mm变焦镜头。而具有Western Blot化学发光成像功能的Invitrogen iBright CL1000印迹膜与凝胶多功能成像系统，用的则是25mm固定焦距光圈系数f-0.95的镜头，其目的就是为了“快”。

2.2 镜头焦距与成像大小

凝胶成像分析系统可检测样品呈多元化，不同样品和不同操作习惯，样品托盘不同，物品与镜头距离存在区别。

根据透镜成像公式，焦距确定后，选定拍摄对象即确定了物距，此时通过对焦环调整透镜和感光元件间距可确保成像清晰。这个过程称为对焦(focus)。可由手动完成（“手动对焦”），也可以是相机自动完成（“自动对焦”）。

譬如，同一块EB染色琼脂糖DNA凝胶，可直接置于紫外台上，也可装于凝胶托盘再转移至紫外透射台观察；紫外透射台叠加蓝光转换板用于SYBR Safe凝胶观察；紫外台上添加白光转换板，可用于考马斯亮蓝蛋白凝胶检测。不同操作习惯和不同应用，会造成物距不同，无论对定焦还是变焦镜头，都需通过镜头对焦环微调像距，以确保图像清晰。

物距U减少，对于固定焦距镜头，像距V增加，结果是图像与拍摄对象比例增加，即图像得到放大。但因像距存在f < v <2f限制，故镜头上下可调范围小于1f。因此，短焦距定焦镜头，对焦只能解决图像质量问题，图像光学放大能力极为有限。

要放大图像需加大焦距。对同一距离同一个目标拍摄，短焦距镜头所得图像小（成像视野大），长焦距镜头所得图像大（成像视野小）。变焦镜头通过调节镜头的焦距来采集不同大小的影像和不同取景范围。譬如先用18mm焦距拍摄得凝胶成像仪整个成像区域全貌预览，再调整为50mm焦距拍照，但拍摄样品图像得到放大。这个功能称为缩放图像功能（Zoom）。

2.3 Zoom功能的应用价值

用凝胶成像分析仪采集实验图像目的无非是用于图像调整处理分析和发文审核。目前SCI期刊插图排版分为半版(8.0cm)，2/3版(14cm)和整版(17cm)三种形式。

根据人体工程学原理，如使用18.5英寸显示器台式机或14英寸笔记本屏幕的水平×垂直分辨率为1366×768像素(1920×1080像素)，无论是提审还是在线浏览，计算表明：半版图水平分辨率达到384像素(560像素)，且垂直分辨率不高于618像素(869像素)时（否则图像会被按比例缩小显示)，视觉体验最佳。最大成像区21×16.8cm的凝胶成像仪生成可供发表的8.0cm图像，CCD分辨率应不低于1.36 MP，否则实施数码放大后，图像美感要大打折扣。

有网友认为，发表JPG/TIFF图片分辨率不低于300dpi以400-500dpi为宜。这显然是把打印机的Dot和电脑显示的像素(Pixel)混为一谈，但也说明发表图像分辨率确应从源头上引起重视。

阿拉斯加科技近期完成了一项的专题调研，意在统计2016年1月-2021年1月发表的采用电泳凝胶图像数据的SCI期刊论文情况。结果显示Science、Cells、Nucleic Acids Res、PANS、Genetics、J Biol Chem、Pharmaceutical Biology等都有相关文章。

2016.01-2021.01 SCI论文电泳凝胶图像应用举例

调研还发现，文中明确所用的凝胶成像分析仪中，有GelDoc XR 2篇、AlphaImager EP、AlphaImager HP各1篇。这几款面世超10年的机型，CCD分辨率均刚达到136万像素标准，离268万像素的要求尚有差距。

这种情况，Zoom是解决图像分辨率不足的最有效办法。将凝胶或培养皿在样品台居中后，启用Zoom控制调整镜头焦距，让图像尽量充满预览框，再聚焦和采集图像，图像分辨率将提升近140万像素，无论是提交审稿还是在线浏览，原图放大也不再难堪。

参考文献：

1. GelDoc XR and ChemiDoc XRS+ Imaging System Instruction Guide Version 6.0

2. GelDoc Go Imaging System with Image Lab Touch Software User Guide（10000125685）

3.  Proteinsimple Alpha FluorChem HD2化学发光凝胶成像系统彩页