如何有效评价凝胶成像分析系统的技术性能-CCD单元

悟凝胶成像系统性能为图像分析开新局-1

      从本篇开始，我们开启《悟凝胶成像系统性能为图像分析开新局》系列专题，通过总结分析凝胶成像分析仪各组成模块的现状和演变，以便全面有效评价凝胶成像分析仪的技术性能。同时，尝试进一步发掘凝胶成像仪的功能应用，让这款经典仪器为实验样品图像分析开创新局面。
      凝胶成像分析仪，是集凝胶成像暗箱、检测光学组件、图像采集单元、电脑操作控制单元等硬件模块于一体，在图像采集和分析软件控制下，采集核酸蛋白电泳凝胶、细菌培养皿、多孔板等多种实验载体样品的图像，并可调用随机软件相应功能插件对图像进行定量、半定量分析的综合软硬件复合系统。
      因此，凝胶成像分析仪又常被称作凝胶图像分析系统（Gel Documentation Systems）。如Axygen的GD-1000 Gel Documentation Systems，伯乐的 GelDoc Go Gel Imaging System，赛默飞E Gel Imager Gel Documentation System及国产勤翔公司GenoSens 2000凝胶成像分析系统等等。
      凝胶图像分析前提是图像的数字化。
      所谓数字化图像（Digital Images）是用沿着x轴（行）方向和 y轴方向（列）方向排列若干正方形像素/像元（Pixels/picture elements）定义图像宽度、高度和每个位置像素强度值的二维网格像素阵列（two-dimensional grids of pixel intensities values）。
      数字化图像生成离不开CCD和CMOS这两个常用的图像传感器。传感器由数十至数百万个具有光电转换和电荷存储功能的像素组成。它利用感光二极管将每个像素收集的光子通过光电转换累积储存电荷，再经模数转换器ADC将电信号转换为图像的数字信号后压缩保存或传输到计算机存储分析。

      正是基于CCD在图像快速捕获与存储中的核心地位，考核评价凝胶成像分析系统的性能，通常可从审视CCD的技术性能开始。

一、衡量CCD技术性能的基本要素

1.1 CCD像素数量

      数字相机的传感器由数十万至几千万个像素呈棋盘状排列组成。相机的分辨率是指CCD或CMOS成像传感器所采集到的单个水平像素（M）与垂直像素（N）的数量总和。传感器的分辨率越高，成像后的图像像素越高，图像轮廓细节就越清晰。

      相机分辨率要根据需求而定，并非分辨率越高越好。高分辨率图像的数据量大，联机的图像传输速度帧率(Frames Per Second，FPS)就迅速下降，图像显示动作迟滞欠流畅。目前，与荧光显微成像系统动辄1000-2000万像素的成像单元比，市面主流凝胶成像系统还以300-600万像素CCD为主。

1.2 CCD像素尺寸

      CCD传感器分辨率还受像素尺寸大小的制约。像素尺寸（像元尺寸）是指一个像素在长和宽方向上所代表的实际大小，尺寸以2-20μm居多。图像大小一定的情况下，像素尺寸越大，分辨率越低，图像清晰度越低。像素尺寸小，相机的分辨率增加，有利于对细小缺陷的检测和增大检测视场。

      像素尺寸大小与图像像素计算公式为：

      据此推导出以下公式：

      公式2说明：图像中一个像素点表示的实际距离 = 像元尺寸/放大倍数（备注：凝胶分析系统中CCD镜头常用的放大倍率有0.35X、0.5X、0.7X，实际是缩小图像而非放大）。因此，像素尺寸7μm的相机对图像分辨率不如4μm的相机。但不能据此认为，像素尺寸越小越好，还应根据样品成像场景要求而定。

      相机的像素在曝光过程中吸收光子转换为电子。感光区域越亮，收集到的光子越多，积累的电荷量也越大。没有吸收光子和吸收光子至满载的像素值分别显示为"0"和"255"，即代表图像纯黑色和纯白色。每个像素接受光信号的过程叫曝光，所花的时间叫曝光时间。

      CCD传感器像素在受到强光照射时，亮点区域像元获得的光照过强，光电二极管产生的光电子数超过CCD电荷容量而溢出，此时溢出的电子将沿行或列方向进入相邻像素，导致在过饱和的像素点附近错误的像素信号值，被“污染”的相邻图像区域出现光晕（Blooming）效果。

      像素面积缩小，能储存的电荷量随之减小。一旦像素满载便会溢出。高光溢出使邻近像素发生“快速充电”，但其实并非因接收光子光电转换的真实值。结果是，图像高光区域部分的信息损失。若采用减少曝光时间来防止高光溢出的办法，则会造成对应于昏暗环境的像素曝光时间不够，得到的像素值太低，这样会导致图像昏暗部分信息缺失。

      而大尺寸感光元件的像素电荷容量大，不易因延长曝光时间而被“填满”，因此，与昏暗环境对应的像素在描绘明亮环境的像素“满载”之前，有更多时间吸收光子，确保画面明暗均衡，实现“淡妆浓抹总相宜”的美好境界。

1.3 CCD像素动态范围

      动态范围(Dynamic Range)是物理学中表示某一物理量最大值与最小值的比率，通常以对数表示，单位默认情况下用分贝(dB)表示，也可以用比特(bit)或挡来表示。就CCD测量而言，动态范围通常是指CCD的最大信号电平与读出噪声电平之间的比值。

      对于真实场景，是指最亮处与最黑处的亮度之比。某一场景的动态范围很广,就是说场景中从阴影部分到高光部分之间的曝光数值相差很大。一般来说，低动态范围的相机噪声比较多，照片会缺失亮部细节和暗部细节。而宽动态范围有利于将场景中极亮和极暗部分细节同时被清晰地显示，画面的对比度高。

      当拍摄不同应用场景的图像时，有两个动态范围是需要考虑的：一是要拍摄场景的动态范围，二是相机的感光元件的动态范围。因此，应尽可能地是相机的动态范围与应用场景的动态范围匹配，以确保图像的亮部细节和暗部细节都完美展现。

      小尺寸像素因光电溢出效应，造成相机动态范围的降低。而大尺寸像素设计，使相机具有更大动态检测范围。

      芯片的动态检测范围扩大，使成像系统可同时应对微弱信号条带、高亮度条带的检测能力得到质的飞跃，特别有利于复杂的科研实验图像分析。

      目前，芯片的动态检测范围从早起的1.8已扩展到3.5-4.0个数量级。

1.4 CCD像素深度

      像素深度（Bit–Depth）是指相机存储每个像素值（intensity of pixel）所用的Bit位数。它决定灰度图像的每个像素可能有的灰度级数（gray levels）或者决定彩色图像的每个像素可用的颜色数。每个像素的比特位数多，图像颜色更接近实物本身。最常见的像素深度有1-bit、8-bit、16-bit、24-bit和32-bit。

      8-bit像素灰度图像（gray image），从最暗黑色到最亮的白色，共有256级灰度可定义。如彩色图像的R、G、B三个色彩分量用固定5-bit表示外加1位属性(Attribute)位，则一个像素的深度为16-bit。如每个像素的R、G、B三个分量每个均为8-bit，则像素深度为24-bit，每个像素可代表224次方种颜色中的一种，对色彩的变现力将极大改善。

      通俗地讲，像素深度代表的是相机图像色调的再现表达能力。

二、凝胶成像分析系统CCD的技术迭代历程

      纵观近20年凝胶成像分析仪技术发展，颠覆性革新就发生在CCD成像单元。

      伯乐凝胶成像分析仪为例，抽取20年前-10年前-目前三个代表性机型，基于官方公开发表技术资料，汇总了不同年代CCD主要性能指标表。

表1  2000-2020年伯乐公司凝胶成像系统CCD主要性能指标对比

      表1表明，20年间，随着半导体和大规模集成电路设计制造工艺进步，CCD的像素尺寸经历了9.8μm、4.65μm、2.4μm瘦身过程。成倍缩小的像素使得在相同尺寸芯片集成更多像素称为可能，推动着凝胶成像分析仪的CCD像素数量一路高歌猛进，从20年前40万像素升至130万像素，又再从400万像素飙升到目前的630万像素。

      近年上市的美国赛默飞Invitrogen iBright CL750 Western blot凝胶成像分析系统 的CCD图像分辨率更是高达910万像素（3380×2704 pixels,像素尺寸2.69μm×2.69μm)。

      CCD像素的增加不仅使图像轮廓细节刻画得更细腻，在对选区的定量分析中，有助于提高选区面积和区内像素强度值的计算精准性。

      CCD动态检测范围的扩大不仅有利于不同部位光线强弱悬殊的样品图像的完美兼容，还扩大了对不同类型属性样品的检测适用范围。

      CCD像素深度的演变，提高了CCD检测灵敏度，使不同条带量化数值更精确。16-bit像素深度计算处理能力，使图像从黑白的混沌豁然迎来五彩斑斓的境地。

参考文献：

1. Bio-Rad Quantity One Version 4.4 User Guide RevA (4000126-14)

2. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)