道妙休云所得迟——单细胞转录组测序分析在MSC应用研究中的价值与策略-下

（前续：单细胞转录组测序分析在MSC应用研究中的价值与策略-上）

三、单细胞转录组测序分析对MSC应用研究的指导意义

       MSCs属异质性细胞群，MSCs细胞群的异质性和功能差异，导致临床实验结果不一致或存在争议，是作为可重复、可预测和标准化治疗方法在临床转化中巨大障碍。因此，通过SCRNA-seq分析技术，鉴定MSCs样本中包括间充质干细胞、祖细胞在内的不同细胞亚群，识别具有不同功能的亚群并加以适当应用，是提升基于MSCs的治疗方案疗效的重要技术途径 ^[15] 。

3.1 优选具有特定治疗功能的MSC组织来源

       据报道，对从同一供体中分离的脂肪来源MSCs（AD-MSCs）与骨髓来源MSCs（BM-MSCs）样品的scRNA-seq分析显示，与 BM-MSCs相比，AD-MSCs细胞群转录组异质性较低，能量生成方面对线粒体呼吸依赖性较低，MCH-I类抗原表达水平较低，而免疫抑制能力较高，运用于骨关节炎治疗的临床实验结果较为一致，治疗效果方面较BMSCs更稳定。表明AD-MSCs更适于在低氧关节腔微环境中存活，且在调控骨关节炎症反应方面可能更具优势 ^[16] 。

3.2 鉴别具有特定治疗功效的MSC亚群

       对临床人体脐带来源MSCs（UC-MSCs）样本的scRNA-seq分析结果显示，UC-MSCs细胞群中存在类似祖细胞和类似成纤维细胞 UC-MSC亚群。具有类似祖细胞转录组的UC-MSC，而非类似成纤维细胞转录组的UC-MSC，可减轻大鼠高氧诱导的肺损伤模型中高氧暴露新生鼠肺动脉高压症。而MHC-I高表达则是非治疗性细胞的分子标志，治疗效果低。因此，scRNA-seq可能有助于识别具有更高修复能力的MSC亚群临床应用 ^[17] 。

       采用scRNA-seq分析人BM-MSCs中的CD271⁺细胞群，鉴定出一个独特的 CD271⁺CD56⁺细胞群，以流式细胞分选法分离出CD271⁺CD56⁺ BM-MSCs亚群，并提取其外泌体（CD271⁺CD56⁺ BM-MSC-Exos）制备CD271⁺CD56⁺ BM-MSC-Exos水凝胶，用于大鼠轴突脊髓损伤（Spinal cord injury, SCI）模型的治疗，被证实具有促进轴突再生的能力，并改善脊髓功能恢复，同时还确认miR-431-3p/排斥性导向分子家族成员 A（RGMA）轴是该过程中的关键调控因子 ^[18] 。

3.3 寻找MSC纯化的潜在特异性细胞干性标志物

       目前，没有基于单一表面标志物的克隆方法能够从各种组织环境中分离出满足MSC最低标准的干性细胞。包括Stro-1、SSEA-4、CD271和CD146等MSC表面标志物可能与细胞干性相关，但它们在不同来源MSCs中的表达水平差异很大 ^[19] 。

       对来自两名受试者的新鲜分离的 CD271⁺ BM-MSCs进行scRNA-seq分析，在CD271⁺ BM-MSCs细胞群中鉴定出 LEPR ^hi CD45 ^low亚群，这一亚群还可进一步分为成骨、成软骨及成脂潜能的不同亚群以及处于静息状态的终末阶段细胞。对每个亚群中高表达基因、生物过程及信号通路之间关系分析表明，成骨分化仅发生于 BM-MSCs 发育的早期，而成脂分化与静息态细胞则在终末阶段占据主导地位。BM-MSC表达的CD271、 LEPR、CD105和CD90等经典细胞标志物中，LEPR具有特异性高水平表达，此外，或CD167b、CD91、CD130及CD118高表达，或CD74、CD217、CD148及CD68表达阴性。CD146则在BM-MSCs成骨亚群中特异性表达。这些标志物有望成为BM-MSC富集/纯化过程中的新型表面标志物 ^[20] 。

四、MSC研究中单细胞转录组测序分析应用的策略创新

       自从ISCT 2006版MSC定义最低标准发布后20年来，与MSCs有关的大部分研究活动中，无论是何种组织来源、细胞分离方法、体外培养接种密度和传代条件、细胞培养设备方法，但凡间充质组织来源细胞满足以下三个条件：1)贴壁生长；2）CD105、CD73和CD90表达阳性且CD45、CD14（CD11b）、CD79（CD19）及HLA-DR表达阴性；3）具有成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞分化潜能 ^[21] ，即可视作纯粹的“间充质干细胞”。不管流式细胞法表面标志物检测结果如何、特定基因转录水平高低，还是细胞分泌组中特异性功能成份含量和临床治疗功效稳定情况，都可名正言顺地视作间充质干细胞的生物属性。

        如今看来，无论“mesenchymal stromal cell”还是“mesenchymal stem cells”，本质上属于不同来源不同、存在多种功能亚群和生物学特性存在显著差异的细胞混合物。其中真正的间充质干细胞群组成占比，至今仍无定论。传统体外诱导分化实验显示，MSCs群中具有完整三谱系分化潜能的细胞数量占比不过50% ^[6] 。而scRNA-seq研究报告中，MSCs样本中具有转录特异性的细胞亚群不低于三个，表达细胞干性有关标志物的细胞比例低于30% ^[14] 。经连续传代培养后，干细胞数量占比还可能更低 ^[22] 。毫无疑问，常规分离纯化模式下所得MSCs，绝非单一组分的间充质干细胞或是间充质干细胞占绝对多数的细胞群。

       细胞的各种生物过程无时无刻不受周围环境的影响。微环境的改变，譬如，细胞从组织中分离进入体外连续传代培养体系，MSCs生存活力、增值与分化、迁移与粘附、代谢与分泌等行为模式必随之发生不同程度的变化。现阶段还无法在实验室内完全复制出间充质干细胞体内特有的生理微环境。一旦失去体内生态位庇护，干细胞、定向祖细胞群的分裂模式将被打乱，定向分化或凋亡的发生，则MSCs群各细胞亚群的规模及比例的变化是必然的。采用多色慢病毒条形码标记技术追踪人脐带来源UCP-MSCs体外扩增各克隆数量动态变化的研究显示，扩增刚启动时，原代MSCs显示是一多种类型细胞群的组合体。随着培养继续，细胞群多样性大幅下降，并在扩增早期传代中观察到第一次克隆种类减少现象，暗示了原始、能启动MSCs培养的细胞群的存在；随后，克隆多样性进一步减少，形成由为数不多的几个细胞群在克隆群体中占主导地位的局面。原代细胞样品、体外培养传代早期和传代10次以后，不同克隆亚群在细胞总群中数量呈现显著此消彼长环境选择效应，对最终细胞总群规模增长的贡献作用不同。表面光学显微镜下看似外观均匀的MSCs，实际由多个亚群体组成，各自具有不同功能。此外还观察到在体外扩增中MSCs显示衰老迹象。因此，MSCs在体外扩增条件和时间的延续，造成MSCs群的整体特性变异，给临床实验结果带来高度不确定性 ^[23] 。

       美国生物学家伦纳德·海弗利克（Leonard Hayflick）等在1961年发现，正常培养的人胚胎成纤维细胞，在依次经历低速原代培养期、中段旺盛指数生长期和末段细胞分裂减速期后，细胞群数量增长停止，发现细胞已不再分裂。据此提出体外培养的正常人体细胞分裂次数存在50±10次群体倍增（population doublings, PD）限制的理论 ^[24] 。学界因此将PD50视为人正常成体细胞体外分裂能力极限——“海弗利克极限”（Hayflick limit）。

       据报道，人骨髓来源MSCs的平均倍增次数到38±4后（相当于每个细胞平均分裂了38次），细胞外形逐渐变得宽扁，生长速率显著降低，进入称为复制性衰老（replicative senescence）的状态 ^[25] 。而在化学成分明确的无异种来源及无血清培养基中，人脐带来源MSCs（umbilical cord‐derived MSCs, UC-MSCs），通过微阵列技术对14500个基因转录谱的检测显示，UC-MSCs在体外传达到平均群体倍增水平（mean population doubling level, mPDL）23时，细胞群无显著转录谱漂移现象，可作为临床转化细胞治疗产品的稳定细胞来源。但传代至mPDL 27时，基因转录谱开始发生显著变化，到mPDL 49时细胞群不同程度接近衰老状态 ^[26] 。

       MSCs作为成体组织细胞，无论来源如何，经过一定分裂次数后当然也会衰老、增殖能力和功能的退化，并最终凋亡。

       由于MSCs是一个异质性细胞群，包含多种不同生长动力学和分裂能力的细胞类型。由于体外培养条件无法保障组织生态位所提供的特定代谢、区室化或其他信号通路传导需求，这些细胞类型在脱离了调控细胞类型平衡的天然微环境后，自我更新能力和多向分化潜能逐步丧失，产生具有不同命运定向性的子代细胞。具有环境竞争优势、增殖较快的细胞类型会取代生长动力学较慢的细胞类型，在细胞群里占主导地位 ^[26] 。无论原代细胞群中细胞组成简繁程度如何，在特定培养条件选择压力下，因分裂增殖、分化和凋亡过程的差异，经历一定时间扩增后，细胞亚群或消失或演变为数量规模占优的优势亚群。因此，体外培养的MSCs群的细胞组成类型、整体生物学功能属性，是动态调整而非一成不变。

       目前学界MSCs有关实践活动存在的主要问题，无论是体外细胞培养与扩增工艺流程设计、细胞生物学特性表征、MSCs转基因操作与细胞表型调控以及细胞分泌组治疗功效评价，潜意识里将MSCs当成作与HEK293E类似的均质细胞系对待，思想尚未完全向MSCs属异质性细胞群的基本事实看齐，技术路线依然未脱离“间充质干细胞”窠臼。甚至，scRNA-seq分析都未能摆脱2006版技术指南的束缚。

       在我们看，目前至少有三个方面的工作要迎来变革。

4.1 scRNA-seq在MSC体外扩增应用的变革

       细胞群组成类型和体外生长属性不同，决定了固定的“通用型”MSCs大规模生产工艺平台几乎不存在。体外培养和扩增工艺，必须针对供体细胞和生物学特性差异、具体应用进行开发定制 ^[27] 。

       探索MSCs细胞群在特定培养环境下各谱系细胞亚群扩增规模变化规律，通过培养条件优化对细胞选择，筛选增殖潜能高、易于培养且培养成本适中的功能特异性优势细胞亚群，是解决MSCs样本亚群更稳健、更具可重复性生产的关键。与先通过scRNA-seq筛选出细胞亚群，再据此开发特定亚群分选工艺筛选出特定属性细胞亚群，最后通过进一步培养扩增以获得特定治疗功效的MSCs细胞产品的研究思路相比，培养条件细胞亚群选择法，显然更简便、经济和可预期。

       因此，体外培养技术体系不仅是一个扩增工艺过程，还是一个细胞选择工具。MSCs培养扩增技术路线应以培养条件选择性结果和MSCs分泌组为导向，而非原代或低传代样品的scRNA-seq结果。

       此外，为确保研究方法路线和实验结果的可比性，MSCs分析报告，应提供完整培养条件（氧分压、接种密度、培养基配方、表面/生物反应器系统以及微环境模拟刺激因子），MSCs的传代次数（passage number,通常用P1,P2,表示）及收获时细胞群体倍增水平PDL（population doubling level, PDL)，细胞群体倍增时间(population doubling time, PDT)以及扩增后细胞的功能特性信息 ^[28] 。

4.2 scRNA-seq分析技术在MSC研究中应用策略的变革

       scRNA-seq研究复杂组织中细胞异质性的强大工具，以前所未有分辨率生成直观的单细胞转录组图谱，将组织分解为特定细胞类型及细胞状态，揭示出复杂而罕见的异质性细胞亚型，并可追踪发育过程中不同细胞谱系的演化轨迹 ^[29] 。

       当前，部分MSCs有关scRNA-seq研究项目，针对MSCs临床转化应用方向和潜力探索指向不明。投入巨大资源产生的研究结果，既未体现出MSCs作为基质细胞固有的旁分泌营养因子效应，也未展示MSCs潜在的促组织修复、抗凋亡、抗炎和免疫调节等有关信号通路调节基因表达富集信息，而是满足于在生物信息数据里转圈，属于以揭示细胞异质性为目标的低价值劳动。

       以MSCs产品临床治疗转化为导向的scRNA-seq研究应用，应注意以下问题：

1）摒弃以ISCT 2006版MSC定义标准为导向scRNA-seq分析思路

       目前MSCs材料的分离，通常是采用CD271、CD44、CD105、CD73、CD90阳性并结合CD45、CD34、CD14、CD79a、HLA-DR阴性的非特异性细胞表面标志物来分离。然而通过这些细胞标志物框定候选MSCs的方案并不理想，一是依赖该方法分离出的细胞依然包含多种细胞类型，二是一小部分MSCs阳性表达传统上均被视为阴性标志物的CD45与CD34这两种标志物，而此前曾被认为不同来源组织间充质干细胞普遍表达的细胞标志物CD105，在BM-MSCs中仅约50%的MSCs呈阳性表达。由此一来，传统多指标结合筛选模式，造成部分MSCs资源的流失，极大限制了新鲜组织分离原代MSCs样本细胞产量和分析数据偏差 ^[20] ，也不利于敏锐反映MSCs体外培养过程细胞群构成的动态变化趋势。

2）scRNA-seq分析技术在界定MSC体外最大扩增边界的合理应用

       scRNA-seq对MSCs样品分析，有助于预判特定细胞群生物功能特性和临床转化潜力。但因体外培养环境对细胞群生存繁殖的选择性效应，样品内部各细胞亚群组成比例是变化的。因此，单一原代MSCs或细胞群快速生长期的scRNA-seq测试结果对研究指导意义有限。发挥scRNA-seq的细胞分群定量检测和细胞潜在功能表型的分析优势，监测特定功能优势亚群细胞增殖状态与潜能、找出各亚群细胞稳定扩增传代的边界，可确保在安全边界以内细胞群具有与早期传代细胞相当的功能状态，对于保持MSCs产品质量和治疗效价稳定性，提升MSCs研究临床转化效率，具有重要价值。

4.3 未来MSC细胞资源高效利用的思路

       鉴于不同来源MSCs在体外培养条件下，不同细胞亚群最终不可避免地因走向衰老而丧失特定治疗功效。采用特异性功能亚群标志物和高通量流式细胞分选等手段，分离和鉴别各优势亚群组分的功能特性并结合各自分泌组表型，进一步构建永生化MSCs功能亚群，开发品质均一稳定的MSCs细胞产品或无细胞分泌组产品，有助于实现质量可控、疗效确切的“细胞药房”目标。

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