道妙休云所得迟——对间充质干细胞重命名深层逻辑的认识

       《MSC干细胞身份之谜》一文提到，无论Caplan为代表的一众学者、还是ISCT，都已不再将MSCs视为“间充质干细胞”。花开两朵，各表一枝，这两派提议MSCs更名的支撑点是不同的。前者是基于MSCs实际发挥的生物学功能——分泌生物活性因子和旁分泌效应，对组织再生和治病治疗中发挥主导作用而提出。而后者则从目前技术条件下实验所用MSCs内部细胞成份的非均一性立论。

       “鉴古而知今，彰往而察来”。讨论更名提议背后的深层逻辑，并非为了简单地理解以实现学术精神层面共鸣，而是为洞察这一提议起源的本质问题，以确定MSCs技术研究的出发点和努力方向。

一、以基质细胞身份属性重新定义MSC

       阿诺德•凯普兰(Arnold I. Caplan)，是“间充质干细胞”命名者和干细胞治疗技术公司Osiris Therapeutics, Inc.创始人，数十年来一直致力于骨关节细胞治疗技术和转化研究。凯普兰及合作者在BM-MSCs体外分化与应用方面的研究，底蕴深厚。是他们率先提出人骨髓来源的MSC(Bone marrow-derived MSCs, BM-MSCs)成骨/软骨/成脂三分化属性 ^[1] 、MSCs旁分泌机制 ^[2] 和MSCs营养效应  ^[3] ，在学界影响深远。Osiris公司之名源自古埃及神话形象Osiris（奥西里斯），寓意干细胞治疗技术对生命活动起死回生的法力。

       BM-MSCs是发现最早，研究最深入的一种MSCs，早已被证明具有多向分化潜能，在体外条件下被证实可分化为骨组织、软骨、肌肉、骨髓基质、肌腱与韧带、脂肪组织以及多种其他结缔组织 ^[3] 。然而，开发用于骨关节缺损再生修复的全新细胞替代疗法，非目前人类认知能力之能及。

       首先，每种组织都是由多种细胞类型组成的复杂组织结构，任何组织的功能实质都围绕着结缔组织细胞。每立方厘米组织区域内，几乎都存在血管（输送养分、排除废物）、交感神经元（中枢控制）和淋巴管（废物清除）。为适应组织代谢需求，身体中绝大多数组织细胞距离血管距离不超过2-3细胞直径范围。因此，修复受损功能组织需同步替换多种细胞类型。譬如，人内皮集落形成细胞 (endothelial colony forming cell, ECFC) 在外周血中循环，并具有血管生成能力。当ECFC与MSCs共移植时，ECFC能以血小板源生长因子BB(Platelet-Derived Growth Factor-BB, PDGF-BB)依赖方式增强MSCs的植入与分化促进组织血管形成。因此，组织修复过程中绝非仅凭MSC一己之力就可实现 ^[4] 。

       其次，MSCs的分化过程涉及由局部微环境中的生物活性因子调控的多步骤细胞谱系分化。这种受控分化机制包含大量调控元件，在分化路径上设置多重制衡机制，即使动物机体生理功能出现短暂失调或遭遇创伤性事件，也不会导致不良终末表型细胞的出现，保障最终分化结果的稳定性。胚胎来源干细胞分化并形成独特的形态学与功能单元，进而整合至机体整体生理系统中。成体干细胞对于在胚胎发育微环境中对那些决定组织边缘（即形态特征）或诱导胚胎功能的胚胎信号分子均无应答。而成人组织损伤的修复过程需将数盎司复杂组织溶解、吸收、再生并进行形态功能重塑，但MSCs自身分化谱系限制了其恢复胚胎发育时期间充质干细胞的组织形态塑造功能 ^[3] 。人类进化过程和定义的成体组织细胞的功能和表型，阻断了特定组织环境和MSCs获得类似于壁虎断尾、蝾螈断肢后所发生残损器官再生这样修复功能。因此，组织器官再生修复技术，远非现阶段所能掌握和支配。

       山重水复疑无路，柳暗花明又一村。1996年前后，Caplan带领的团队发现，MSCs能高水平表达和分泌包括 VEGF-A、ANG-1、肝细胞生长因子（HGF）、白血病抑制因子（LIF）、 IGF等多种生物活性因子，并以自分泌(autocrine)、旁分泌(paracrine)及近分泌(juxtacrine)形式，直接或间接地调控骨髓微环境中其它细胞的有丝分裂、代谢或发育状态，对骨髓造血环境有支持作用 ^[2] 。MSC作为基质细胞，可在自身不分化情况下，以分泌特异性生物活性因子对周围组织细胞发挥营养效应，帮助骨髓中HSC及衍生祖细胞的存活和“繁荣” ^[3] 。成体干细胞是作为机体组织的储备细胞而存在，可为受损组织修复再生和组织功能扩展提供所需细胞来源。MSCs定位到损伤或病损部位后，分泌生物活性因子，作用于特定部位和组织驻留干细胞，促进组织干细胞及衍生的各种细胞谱系完成组织的再生与重塑 ^[5] 。

       在MSC命名提出18年后，Osiris Therapeutics公司人BM-MSCs开发成功的细胞产品Prochymal，竟然与其心心念念的MSCs体内移植治疗骨骼组织炎症及损伤疾病毫无关联，却一鸣惊人成为全球第一款移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)异体细胞治疗药物 ^[6] ，并已在加拿大、新西兰、日本和美国上市。

       正是GVHD这样的成功治疗实践，进一步推动了MSC 研究范式转变——从细胞替代疗法转向旁分泌疗法。因此，在Caplan为代表的学者看来，干细胞之于MSCs有名无实，更名也就水到渠成。

二、以细胞群内部组成异质性审视MSC的干性定位

       一般认为，干细胞特性有2个基本特性。一是多谱系（multilineage）细胞分化潜能，可分化为所在组织中全部细胞类型。二是自我更新（selfrenewal）能力 ^[7-8] 。Potten和Loeffler在1990年提出，成体组织是一种包含干细胞、过渡细胞及成熟细胞的结构化细胞群。干细胞可分裂但功能不成熟，而功能成熟的终末分化细胞则不分裂。过渡细胞（transit cells）是介于干细胞与功能成熟细胞间的中间状态细胞，其功能成熟度高于干细胞且具可分裂 ^[9] 。大多数成体组织干细胞的无限自我更新能力，源于无限不对称分裂（asymmetric divisions）潜能。所谓不对称分裂，即干细胞分裂后，产生一个干细胞子代，同时还产生一个已分化的定向祖细胞（committed progenitors）。一个旧干细胞消亡，由其子代干细胞替代而实现干细胞群的更新，干细胞总数不变。故历经分裂而干细胞池规模得以维持。而另一个分化的子代细胞，则用作组织中祖细胞补充。定向祖细胞为过渡扩增群体（transit amplifying population），只具备有限次数的不对称分裂能力和较少谱系细胞的分化潜能，故不属于干细胞，主要承担常规组织更新任务 ^[10] 。

       在ISCT专家委员看来，MSCs之所以不能称为干细胞，主要是因为MSC细胞群组成的异质性。MSCs是包括成纤维细胞、肌成纤维细胞、少量干/祖细胞组成的异质细胞混合群。譬如，BM-MSCs内部可能同时包含有骨髓间充质干细胞、成骨祖细胞、成软骨祖细胞和成脂肪祖细胞等分化程度不同的多种细胞。

       ISCT 2006版MSC定义指南中，MSCS须表达CD105、CD73和CD90，且不表达CD45、CD34、CD14(CD11b)、CD79α(CD19)以及HLA-DR ^[11] 。但实际上，部分AT-MSCs可呈CD34+，且体内MSCs可能比体外培养MSCs更易呈现CD34+，而体外培养基中加入类胰岛素生长因子1（IGF-1）可上调CD34表达。因此，新版MSC临床报告技术指南中，CD34表达阴性规定已被删除。此外，在干扰素-γ刺激下，无论小鼠MSCs还是人类MSCs，HLA-DR表达均上调。可见，目前定义MSCs身份的细胞表型标物的表达具有可塑性，对MSCs细胞群组成的界定有误导风险 ^[12] 。目前，无确切特异性的细胞表面标志物，可有效识别MSCs细胞群内的定向祖细胞谱系和间充质干细胞。群内谱系和分化层级结构不明情况下，将一群自我更新和分化潜能不一致的细胞群认定为属性均一的干细胞势不可取。

此       外，大多数报告的数据来源于体外培养细胞。由于MSC在体内外和生理状态缺乏等效性，原代MSCs经体外培养和测试处理，就已发生某种程度定向分化。单凭MSCs体外三谱系分化结果，不足以界定其干细胞属性 ^[13] 。

2.1 MSC组成异质性问题浮现由来已久

       MSCs为异质细胞群问题，早在“间充质干细胞”命名前就已初露端倪，但未曾引起人们的警觉。

       Friedenstein研究的小鼠CFU-F集落群在植入动物体内后，有15% CFU-F为双分化潜能——产生骨和骨髓器官，另有15% CFU-F为单分化潜能——仅生成骨组织，而其余70% CFU-F则只能形成软结缔组织或未能形成任何组织。这说明，CFU-F群体外扩增集落间分化潜能的差异化。牛津大学莫琳•欧文（Maureen Owen）指出，CFU-F是由基质干细胞和其分化衍生的一种或多种谱系的定向祖细胞（lineage-committed progenitor cell）混合。其中一部分属于具有自我更新和多分化潜能的干细胞，而另一些CFU-F则属于分化程度较高、分化潜能有限的间充质祖细胞 ^[14] 。因基质干细胞和祖细胞无法通过形态学直接鉴别，加之特异性标志物缺乏，故难以清晰解析骨髓间充质细胞体系的分化和谱系层级结构。对此，欧文和Friedenstein已有共识 ^[15] ，但主要精力和重点放在了细胞群里存在干细胞的确认和查证上。

       传统骨髓BM-MSCs分离基本流程是，从捐献者收集10mL骨髓抽吸液，经密度梯度离心后分离其中的1.073 g/ml密度层细胞，再用体外贴壁培养法去除HSCs等非贴壁造血系细胞获得人BM-MSCs。经连续传代扩增的BM-MSCs，SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124表达为阳性，CD14、CD34及CD45其他造血谱系标志物为阴性。在经12次传代后，BM-MSCs保持正常核型和端粒酶活性，并在体外可分化为成骨、软骨和脂肪细胞 ^[1] 。这则1999年发表的关于人BM-MSCs的研究报告结果，已被同行引用达31127次。在关注文中BM-MSCs分离、培养和表征方法和严谨实验对照设计时，读者不应疏忽文中的几组数字：虽然流式检测显示BM-MSCs表型均一度高达98%，但挑选其中6个克隆经体外诱导分化后，5个克隆分化为成骨/脂肪细胞，1个克隆为成骨/成软骨细胞，仅有2个克隆为标准三谱系系分化。可见，看似表面标志物表达均一的BM-MSCs，实际在分化潜能上为异质性，说明BM-MSCs仅一部分可能为间充质干细胞，此外还有大量分化程度不一的间充质祖细胞。祖细胞出现，一种可能是细胞分离操作、多次连续传代操作等各种外部干扰，导致干细胞出现分化所致。而另一种合理解释是，原代BM-MSCs中原本就存在分化潜能受限的定向祖细胞。

       有分析指出，经典BM-MSCs研究流程获得的体外扩增产物，只有少数细胞是真正的多能干细胞。其余大多数可能属已定向分化、功能较更成熟的祖细胞，故仅保留有双系或单系分化能力 ^[16-17] 。另一项对185个人BM-MSCs样品的三谱系分化能力评估测试显示，所有克隆都分化为成骨谱系，其中约1/3克隆能分化为三条谱系，60-80%克隆显示出成骨-成软骨潜能(osteo-chondrogenic potential)。随着细胞群倍增数增加，克隆逐渐失去其成脂和成软骨的分化潜能。表明BM-MSCs体内分化具有早期三能性(tripotent)骨髓基质间充质祖细胞—→中期成骨软骨源性祖细胞—→晚期成骨祖细胞—→终末成骨或成软骨细胞递进式谱系分化模式  ^[18]  ，这是一个基质细胞不可逆地丧失分化潜能的过程。

       无论是从骨髓、脂肪组织、脐带华通氏胶（Wharton's jelly）或脐带血，还是经动员的外周血及其它组织中分离获得的细胞群，实际都属于异质性的间充质祖细胞/干细胞池。细胞池可按层级化方式组织，不同谱系和层级细胞，具有不同程度的分化可塑性与自我更新能力 ^[7] 。

       近年来，随着单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）、生物信息学数据分析等新分析技术的运用，为解析MSCs中定向祖细胞/干细胞群体的表观基因组、转录组和分泌组层面的差异提供了可能 ^[12] 。譬如，对流式表面标志物检测呈CD29⁺、CD44⁺和CD105⁺且CD14^-、CD45^-和HLA-DR^-的BM-MSCs，采用scRNA-seq技术对，鉴定出MSCs中存在三个主要细胞亚群：CD26干性亚群、CMKLR1功能亚群和增殖亚群。发育轨迹分析表明，CD26干性亚群可以分别分化为CMKLR1功能亚群或增殖亚群。CMKLR1功能亚群在免疫调节和成骨分化方面能力强，但脂肪分化和增殖潜力弱。比较不同传代代次MSCs的scRNA测序数据发现，CMKLR1功能亚群在第3代细胞群中比例高于第1代细胞群，还在第3代MSCs中鉴定出一个与衰老细胞相关的新亚群 ^[19] 。scRNA-seq数据验证了BM-MSCs为异质性细胞群混合物的观点，还有力地支持了体外连续传代培养会引起细胞分化干扰的推测。

2.2 MSC群中干细胞数量的低占比问题

       采用贴壁培养筛选法分离获得的间充质干细胞含量较低。人体骨髓抽取液经密度梯度离心后的细胞层中，约0.001%-0.01%的细胞是间充质干细胞（备注：其实是间充质干细胞及多谱系祖细胞的总数，下同） ^[1] 。外周血PB-MSC的克隆形成效率为每百万单核细胞中1.2-13个 ^[20] 。

       将人AD-MSCs的scRNA-seq测序数据，与UC-MSCs、PM-MSCs、BM-MSCs、ESCs、iPSC、HSCs、神经干细胞（NSCs）以及羊水细胞公共样本数据对比显示，所有MSCs中与细胞代谢相关、分泌调控因子有关5个功能基因（TMEM119、FBLN5、KCNK2、CLDN11和DKK1）为高表达。表明MSCs存在显著的谱系定向分化。最值得关注的是，MSCs群中分别仅有0.16%-1.55%的细胞表达了表达一个或多个基因与干细胞自我更新和分化相关的8个关键基因（SOX2、NANOG、POU5F1、SFRP2、DPPA4、SALL4、ZFP42和MYCN） ^[21] ，证明不同来源MSCs中确有数量稀少的间充质干细胞存在，可帮助人们破处挥之不去的MSCs干细胞情结与迷信观念。

三、结语

       在高度依赖流式细胞法检测细胞表面标志物界定MSCs属性的年代，受限于特异性表面标志物匮乏，对MSCs内部细胞组分的辨识度极低。在对MSCs样品内部细胞的真实构成还茫然不知情况，潜意识地把这些细胞视为属性均一的干细胞群并形成思维定势，抛弃审视科学实验结果无偏倚原则，对新发现和实验中异常线索，丧失应有敏锐感。
        在既往许多研究中，人MSCs采用相对较高（5000 个细胞/cm²）接种密度进行传代培养，约 2 周内细胞数量可扩增 3–5 倍，MSC形态均匀且某些表面抗原表达均匀。早在1981年就有报道指出，在极低接种密度（1.5 或 3.0 个细胞/cm²）条件下，人BM-MSCs原始细胞群中可区分出I 型和 II 型两种细胞：在传代培养过程中，I 型细胞逐渐减少并消失，而 II 型细胞在细胞群体中占比则持续增加。克隆实验证实I 型细胞为“祖细胞”，并可分化为无分裂潜力II 型细胞 ^[22] 。后有研究证实，单一人MSCs中有形态上截然不同的2个细胞亚群：其中一群细胞体积较大、复制速度低，另一群为梭形、直径约7μm的小细胞，自我更新速度极快，可进行对称及不对称复制，还具有多谱系分化能力，可能是同一培养物中更成熟另一种细胞的祖细胞^[23] 。这些迹象也表明，MSCs是形态和功能特征异质群体，内部细胞组成、自我更新能力均有差异^[24] 。
        不同组织和捐献者来源MSCs样本内部细胞群组成结构差异化，加上体外培养扩增条件、传代代次与培养时间变化，使得=细胞群整体功能表型发生飘移，对相同实验干预措施和培养环境信号刺激响应方式变化，易造成MSCs分泌表型失控。在人们还普遍对所研究细胞感知处于模糊状态下，根据MSCs基质细胞的支持属性，聚焦细胞分泌组生物学功能，成功开发出有一定疗效的细胞治疗产品，实乃幸事。要小称为MSCs技术研究转化的幸运者，未来的机会一定是对MSCs分群，针对不同亚群功能属性而因群施策，优化培养条件以获取表型差异化、功能和适应症不同的多种MSC分泌组产品。

       无论是Caplan从细胞功能角度重新定义MSCs生物特性，或ISCT提出MSCs细胞群中真正间充质干细胞稀少、大部分细胞属低分化潜能祖细胞的论断，目前都已得到单细胞转录组测序分析技术的有力支持。总之，特定组织中间充质干细胞，只能是功能特性均一的同一种细胞而非一群分化程度存在代差的异质细胞混合群。基于目前人类实验技术能力，间充质干细胞一词的使用，应该缓行。

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