零丁洋里叹零丁——从冷冻保护剂的化学特性看细胞延迟性死亡的应对策略-中

 （续：从冷冻保护剂的化学特性看细胞延迟性死亡的应对策略-上）

二、水的分布与细胞结构和功能的密切联系

       细胞内水分子有两种形态，一种是自由水，另一种是结合水。两种形态的水在细胞中各自有其独特生理作用。维持胞内两种形态水的平衡，对于维持细胞生理功能和结构的正常至关重要。

2.1 自由水的分布

       自由水即体相水（Bulk water）或称为游离水（Free water），是指没有与细胞组成结构、分子、离子等组分结合的水，可通过渗透、扩散、主动转运等多种机制自由进出细胞膜和细胞器，是细胞养料和代谢废物传输载体，参与酶活性催化、基因表达调控和信号传导等生命活动，还是水解反应、离子水合作用等生化反应的底物。

2.2 结合水的定位

       结合水是指分布在蛋白质、核酸或脂质等生物大分子、各种离子结合的水分子层。受离子静电作用、氢键、范德华力、长程库仑力（long-range Coulomb forces）和疏水作用力（hydrophobic forces）等因素节制，这部分水无法自由扩散 ^[30] 。20世纪50年代发现生物分子结合水存在后, 大量研究证明生物结合水是生命活动中不可或缺的有机组成部分，在维护生物大分子的结构、稳定性以及调控动力学性质和生理功能等方面起着决定性的作用。

       生物结合水分为三种类型：（1）溶剂壳（solvation shell），又称溶剂化层，是指在溶质与溶剂间的静电作用、氢键、范德华力等相互作用下，由溶剂分子有序排列包围溶质粒子形成溶剂壳。壳结构通常包括第一溶剂壳层和第二溶剂壳层。第一溶剂壳层由直接与溶质离子配位的溶剂分子组成，而第二溶剂化壳层则包含受溶质离子影响但未直接配位的溶剂分子或离子对。水溶液中形成的是水合壳。细胞内部大量无机离子、生物大分子的荷电基团因静电效应，吸引水分子围绕其周围径向排列，形成与离子或离子基团缔合的水合壳。离带电粒子近的水合层中水分子排列有序，层级向外拓展则水分子排列有序性降低。此外，Na+、Ca2+等小离子则可能嵌入水分子晶格中。（2）生物分子中的极性基团则与水通过氢键相互作用形成极性水合层。（3）非极性基团疏水作用会增强水分子间相互作用，围绕大分子成疏水水合层。在紧密缠绕的分子链间隙中，水分子嵌入形成称为毛细管水的结合水。

       与蛋白质结合水分子分为表面水合作用和内部水合作用两种。在蛋白质的表面，水分子会与极性和带电的基团形成氢键或静电相互作用而围绕在蛋白质表面，形成一个动态的水合壳层。研究显示，不同个体、不同类型的细胞，有3%比例的结合水包裹在可溶蛋白质周围，形成厚度相当于一层水分子厚的壳。跟普通的体相水相比，这一水壳内部氢键结构较弱，水分子排列无序程度接近于水蒸汽 ^[31] 。而蛋白质内部的水分子则通常位于蛋白质结构空腔或裂缝中。因空间维度、孔隙尺寸、界面性质(亲疏水性、刚性柔性等)、外界环境(温度、压力、电场等)的条件限制，生物结合水部分的氢键的数量和结构变化与体系水不同，决定了其不同于体相水的理化特性 ^[32] 。

       蛋白质与水分子形成的氢键网络，推动蛋白质进入折叠状态并维持其二级、三级结构的稳定 ^[33] 。而疏水作用力驱动着蛋白分子中疏水基团聚集和蛋白质折叠。许多蛋白质分子的构象动态变化与水分子的介入程度有关。蛋白质水合作用必须达到一定程度才能发挥正常功能活性。某些蛋白质空间结构还因水含量不同而异。几个关键靶位结合水分子数的变化，会引起聚赖氨酸及聚谷氨酸等同族多肽的构象发生α→β→γ间的转变。譬如胰岛素，必须在水膜引导下才能形成能降血糖的三维结构。胶原蛋白单螺旋之间的水桥是维持三股螺旋结构的必要条件。蛋白质水合过程，调控着蛋白质离子通道开关、蛋白-蛋白识别、配体和药物结合、酶催化等生物过程 ^[34] 。

       实际上，细胞膜脂膜双层结构、核酸、胞内多糖、脂质等生物大分子和带电粒子，皆因水合作用而维持特定的三维构象和功能活性。

2.3 细胞生命活动对水的调节

       蛋白质自身功能活动可调控两种形态水的分布和平衡。超过1/3的真核蛋白质中存在被称为“固有无序区（intrinsically disordered region, IDR）”的特殊结构氨基酸片段。它们与其他具有基因表达调控功能的生物因子间的结合，并非基于传统蛋白间三维构型匹配关系，而是由氨基酸序列的化学性质（如电荷、疏水性等）驱动。研究表明，在低渗环境和/或高温条件下，蛋白质会溶入胞质而暴露出IDR，水分子与IDR的结合后，使局部自由水分子数量减少。相反，在高渗环境和/或低温条件下，蛋白质凝聚，IDR与相应大生物分子结合而并释放所结合的水分子，使细胞内局部自由水分子增加。蛋白质在不同功能活动状态下构象的转换，可调节维持结合水和自由水的平衡以有效应对环境胁迫 ^[35] 。

       生物体内，结合水与自由水会随着环境温度变化、细胞所处环境渗透压和细胞新陈代谢活动水平而相互转换。温度升高，则结合水释放成为自由水，自由水比例的增加，意味着生物体新陈代谢活跃。而温度降低，自由水大量转化为结合水，新陈代谢活动因此而放缓。当自由水含量的异常波动，将造成细胞内两种形态水分布的失衡，可对细胞结构与功能调控产生广泛影响。

三、冷冻保护剂的应用对细胞结构与功能的影响

       1965年的美国低温生物学会（Society for Cryobiology）年会上，学者们一致认为，动物细胞在冷冻时需要至少用一种低温保护剂（cryoprotectant）或低温防护剂（ryoprotective agent, CPA）对细胞进行特定处理才能使细胞存活。而甘油和二甲基亚砜（DMSO）作为保护剂的发明和使用，是低温生物学技术发展里程的分水岭。

       细胞冷冻保存过程中，CPA的保护作用形成机制，一般认为可能与包括氢键调节、细胞膜特性改变、溶液稀释效应及溶液增加粘度等多重因素的协同作用有关 ^[6] 。

3.1 CPA与水分子间氢键的生成和影响

       分子间氢键广泛存在于化学、生物、材料等分子体系中, 在分子识别、维持蛋白质二级和三级折叠构象、DNA螺旋结构形成、分子自组装等方面发挥重要作用。包括甘油、DMSO、乙二醇、PG等小分子膜渗透型CPA，均可通过羟基、甲基或亚砜基等极性基团，与水分子、蛋白、脂质成份形成氢键，改变细胞内部水的氢键网络 ^[14] 。

       羟基(-OH)是参与分子间氢键的重要化学基团之一。乙二醇由两个亚甲基和两个羟基构成，在乙二醇溶液中至少存在两种形式的分子间氢键，一种是水-EG分子间的强氢键相互作用，另一种是EG分子间氢键 ^[36] 。甘油则能参与6-12个氢键的形成，其与水形成的氢键寿命均长于水-水或甘油分子间的氢键。DMSO分子具有一个亲水的亚硫酰基（极性基团）和两个疏水的甲基（非极性基团），与水之间会产生强偶极-偶极和氢键相互作用。DMSO的亚砜基与水分子形成氢键强度远高于水分子间形成的氢键强度，DMSO-水间氢键寿命水分子间氢键寿命的数倍 ^[37] 。体相水中氢键网络的动态变化属性，为在相对稀释的CPA溶液中，CPA与水分子间的强大的氢键相互作用替代部分原有水-水氢键网络提供便利，增强了溶液水分子氢键网络结构 ^[38] 。

       而CPA通过氢键吸引水分子生成的溶剂化壳层，则可调节胞内水分子排列和分布。譬如H₂O/DMSO溶液中，微观液–液相分离形成纳米级的DMSO分子簇和水分子团簇。由于DMSO强极性作用，DMSO溶剂壳中对第一溶剂化壳层之外的壳层水分子约束更强，壳体系的结构更稳定，体相水中水分子“被锁定”在DMSO水壳层体系内，胞内体相水份额减少，故可抑制自由水分子簇和四面体网络结构的生成 ^[39] 。水分子围绕CPA分子的强水合作用，与围绕细胞质膜、蛋白、核酸等细胞成分发生的水合作用存在竞争关系。随着CPA浓度增加，越来越多水分因进入CPA分子的水合层，体相水分子被持续大量消耗，削弱了个细胞组分的水合作用 ^[40] 。CPA分子极性越强，对水亲和力大，与蛋白等细胞组分间水合作用的竞争中就越有利。吸引胞内组分外围水分子逐步解离流失，胞内自由水、结合水分子重新转移分配，危及细胞膜、细胞器质膜和胞内区室中生物活性大分子正常构象的稳定性。

       强极性膜渗透型CPA分子与细胞各组分之间水合作用竞争冲突在细胞内广泛存在，只是不同生物分子、不同功能结构在水合竞争冲突受损程度不同而已。通常，该组分与水分子结合力越弱，越容易受CPA水合作用干扰，功能越容易受损。CPA暴露引发细胞内水份流失，加上CPA水合作用竞争，造成胞内自由水与结合水分布失衡，干扰DNA、蛋白质及其他大分子活性构型，会导致各种细胞器的结构完整性遭受不同轻重不同的损害 ^[3] 。

       关于CPA与蛋白相互作用对蛋白功能构象的影响，目前意见不一致。蛋白质表面上的疏水或氢键相互作用不足以产生寿命超过几纳秒的DMSO−蛋白复合物，推测低浓度(<10%）不会对折叠蛋白的结构或稳定性产生显著影响。但DMSO浓度变化会对溶剂粘度产生显著影响。在DMSO体积比0–20%浓度（相当于摩尔分数为0–0.06）区间，溶液粘度随DMSO含量的增加线性提升超过3倍。粘度增大会造成蛋白旋转、扩散、聚合所需时间发生明显变化，干扰蛋白与配体结合和跨膜转运能力 ^[41] 。根据蛋白分子中的IDR序列的分子识别与相互作用机制，我们更有理由相信，CPA干扰了水中氢键网络构象，会对IDR的基因表达调控功能带来不利影响。

3.2 CPA对细胞膜功能结构的影响

       生物膜是指细胞本身及胞质内叶绿体、细胞核、线粒体、高尔基体、液体泡和内质网等细胞器与外界相隔的双分子层状膜结构，充当着细胞内外环境的屏障，主要成分为磷脂。磷脂是双亲性分子，头部为1个极性亲水头，借助氢键和周围水分子相互作用；尾部为2个脂肪酸链，通过疏水作用彼此接触。不同类型生物膜中脂质、蛋白质的组成比例存在差异，代表了膜功能的多样性。通常，膜和所在细胞器功能越复杂，则蛋白质含量越高；功能越简单，蛋白质含量越低。

       磷脂双分子层状膜结构的内外表面都是亲水的，所以在水环境中能稳定存在，借助于膜透性吸收水，还能保持胞内含有适量的水。膜脂的流动性是指膜脂处于液晶态，磷脂脂分子能进行多种运动。膜流动性的维持需适当水合作用与和适宜的温度条件。局部水环境变化导致膜流动性降低，将直接影响跨膜运输功能，损害细胞生理活动。

       研究发现，浓度低于≤7.5mol % DMSO水溶液中，DMSO通过将水分子与脂质表面解耦（表面脱水），提高凝胶相DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）模型双层表面的水分子扩散率，将结合的水分子释放到体相水中，降低膜双层间排斥力（包括横向和双层间）的作用范围和强度，应对在冷冻水结晶时对膜结构应变 ^[42-43] 。当DMSO浓度超过50%（重量体积比）时，DMSO能够破坏层状液晶相的稳定性，降低了分子间的固有排斥力，促使这些磷脂分子更倾向于形成稳定凝胶相。但凝胶相与晶体相稳定化特性或许能解释高浓度DMSO的细胞毒性作用。

       DMSO通过降低双层-溶剂界面间的排斥力，有效缩小了双层之间的间距，影响溶质跨生物膜被动渗透作用。溶质跨膜被动渗透动力学关系可用公式J = -Dβ/l(△C)表示。l代表膜厚度，即扩散路径长度。J表示溶质沿浓度梯度方向,即浓度梯度△C递减方向的净通量。D为膜内溶质扩散常数。β是溶质在膜水相与碳氢化合物相间的分配系数。l缩短将有效提升溶质扩散通量。另一个可能受DMSO影响的因素是分配系数。DMSO在界面区域的定位将影响溶质从水相向膜疏水域转移的活化能。极性溶质DMSO从膜界面处溶质中移除水合水分子，可能导致被动扩散的活化能显著降低。

       采用分子动力学模拟方法，对膜渗透型CPA分子对生物膜脂质双层结构、动态及功能影响的研究表明，在乙二醇、丙二醇和甘油等醇类物质存在时，醇类与脂质头基之间的氢键取代了原有的水-脂键，脂质头基发生部分脱水，导致双层膜的横向扩展和变薄。CPA能以浓度依赖方式调控生物膜通透性。体积分数5%浓度的DMSO会降低细胞膜厚度，增加膜的渗透性。在常规使用浓度(10%体积分数）下，DMSO会诱导水孔形成，促使CPA分子取代水分。当DMSO浓度升高至更高且更具毒性的水平(40%体积分数）时，还会破坏磷脂双分子层结构 ^[44] 。据报道，DMSO会破坏磷脂膜水合作用，破坏细胞膜、核膜、线粒体膜的结构完整性 ^[45] 。研究证实，膜穿透型CPA可能是导致线粒体膜变化，电子泄漏(electron leakage)和活性氧（reactive oxygen species, ROS)）增加，产生细胞器特异性毒性 ^[46] 。

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