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零丁洋里叹零丁——从冷冻保护剂的化学特性看细胞延迟性死亡的应对策略-上
处在−130℃至−196℃的深低温环境，可显著抑制生物组织内部的新陈代谢、延缓导致离体储存期间的化学降解，有助于在解冻后最大程度地保持冷冻前的功能状态和结构的完整性。目前低温保存技术已被再生医学应用、辅助生殖治疗、畜牧动物繁殖、濒危物种保育、生物种质资源保存等众多领域广泛应用。
尽管低温冷冻保存方法历经数十年研究已大有进展，但诸如干细胞、重要组织（如皮肤、血管和软骨）和生殖器官（肿瘤生育环境中的卵巢和睾丸）等组织类型的保存仍面临回收率低的挑战。
据报道，传统冷冻保存方案中复苏后的干细胞损失占比可高达60-70% [1] 。近年来，人类胚胎干细胞（human embryonic cell, hES）在临床治疗、基础科学研究及体外药理毒性筛选中的潜在应用而引起广泛关注。然而，hES对冷冻保存高度敏感性，采用常规体细胞和鼠类胚胎干细胞冷冻保存方案保存，hES细胞存活率只有5%左右 [2] 。人类胚胎细胞解冻后发生大量死亡的机制尚不十分明确，分析可能与冷冻期间细胞质中发生冰晶损伤有关 [3] 。人体干细胞、类器官的高效冷冻保存方案缺乏，已成为制约这些新型细胞治疗手段研究应用的主要瓶颈。建立一种能最大限度降低细胞损失、分化率的高效干细胞材料冷冻保存方法，具有重要科研和临床应用价值。近年来，针对干细胞、类器官冷冻保存技术的开发研究有升温趋势，并已取得在工程技术上的重大突破 [4] 。
本文总结了目前学界对冷冻保存相关的细胞死亡原因的基本看法，同时还从水分子与细胞密切相互作用角度出发，结合低温冷冻保存过程中常用冷冻保护剂的化学特性，对低温保存解冻相关细胞死亡的可能诱发机制作了探讨，并对可降低细胞冷冻损伤、提高细胞回收率的新型保存方案开发策略作了点评。
一、对冷冻保存过程中细胞死亡现象的认识
1.1 经典细胞死亡冰晶说
巴西尔·卢耶特（Basile J. Luyet）是1964年美国低温生物学学会成立时的首任会长 [5] 。他1927年在瑞士日内瓦大学获得物理学博士学位后留校任教，1929年前往美国耶鲁大学从事生物学博士后研究。1931年始在美国圣路易斯大学担任生物学副教授，正式开启了低温生物学的研究生涯。1934年，创办学术期刊《Biodynamica》，卢耶特是编辑、出版人兼主要撰稿人之一 [6] 。自然科学和物理学研学经历与德国物理化学家塔曼（G. Tammann）的结晶动力学原理理论，使卢耶特具备了用物理定律来定义生物学中物质的状态的学术思维。是他将物理化学与生物学结合而推动了一个新的科学分支——冷冻生物学的诞生。
卢耶特在“The Vitrification of Organic Colloids and of Protoplasm”（有机胶体与原生质的玻璃化）一文中提出了低温生物学领域的一个基础理论：细胞内对冰核和冰晶形成的控制，是决定所有冷冻保存细胞活性的关键环节。胞内液态水转化为冰晶的聚集状态变化，是细胞死亡的首要诱因。为抑制结晶过程，吕耶特提出了 “玻璃化(Vitrification)”的概念原理，是将液态物质转化为无晶体结构的类玻璃非晶态固体 [7] 。
1938年，卢耶特和Hodapp报告了第一个玻璃化冷冻保存精子的成功案例。1940年，卢耶特与Pierre M. Gehenio修女在“Life and death at low temperatures”（低温下的生与死）著述中对玻璃化的基本原理做了阐释：“使物质玻璃化的唯一方法是将其置于液态或气态并迅速冷却，以便在比材料冻结所需的时间更短的时间内跳过结晶温度区域”。而“为避免冻结，物体温度应以每秒数百摄氏度的速度下降”[8] 。晶核一旦形成，晶体的生长速度会进一步加快。若要避免结晶，物质必须快速度降温越过溶液冰点。当温度到达玻璃化转变温度以下时，溶液中就已成非晶态固体，水分子热运动被严格约束，相互间无法聚集而保持无序分布状态。
格雷戈里•M•法伊(Gregory M. Fahy)为美国红十字会的应用冷冻生物学家。他继承了卢耶特的玻璃化思想，提出通过玻璃化冷冻技术器官保存的技术构想，并在1985年的小鼠胚胎玻璃化保存获得成功小鼠胚胎冷冻玻璃化保存技术 [9] 。法伊以较低的冷却速率实现样品的玻璃化转变，将原本小体积样品适用的处理技术拓展应用于大型组织和器官冷冻保存，实现了玻璃化冷冻保存技术理念实用化 [1] 。90年代中期后，玻璃化冷冻辅助生殖技术成功案例涌现，充分证明玻璃化保存方法冷冻损伤风险低、细胞存活率高的优势 [10] ，得到学界普遍关注和认可。
彼得•马祖尔(Peter Mazur, 1928-2015)是低温生物学界的另一位泰斗，曾于1973-1974年担任美国冷冻生物学会会长。他发表的170多篇学术论文中，有4篇为科学界奉为“引用经典”（Citation Classics）论文。马祖尔创立了冷冻保存领域著名的“冷冻损伤的双因素假说”（Two-Factor Hypothesis of Freezing Injury），并据此提出来细胞保存中间速度冷冻保存法——缓慢冷冻保存方法的原理方法。
1963年在“Kinetics of Water Loss from Cells at Subzero Temperatures and the Likelihood of Intracellular Freezing”一文中，马祖尔指出，细胞缓慢冷却降温可提高细胞存活率。在“The Role of Cell Membranes In the Freezing of Yeast and Other Single Cells”中，他深入探讨了酵母及其他单细胞的细胞膜特性如何影响细胞在冷冻过程中的存活或死亡概率。1970年，通过对比不同冷却速率对细胞存活率的影响后，他指出，实现细胞最高存活率所需的冷却速率因细胞类型而异，而且与冷冻溶液中的盐浓度密切相关 [11] 。1972年，马祖尔与合作者在“A Two-Factor Hypothesis of Freezing Injury: Evidence from Chinese Hamster Tissue-culture Cells” [12] 中正式提出了“冷冻损伤的双因素假说”的术语并进行了阐释。
双因素假说的要旨有以下几点 [13] ：
1）冷冻过程中细胞损伤是盐浓度和冰晶两种因素共同作用的结果
高盐浓度损害与缓慢降温方式相关，而冰晶损害发生于快速冷却模式。细胞溶液冷却时，温度下降到溶液的冰成核温度后，胞外水会与溶解盐分离而首先结冰。随着冰晶形成，未冻结溶液中的盐浓度逐渐升高，造成了胞膜内外盐浓度的差，进而推动细胞内的水分子通过渗透作用向高盐区域迁移，以维持细胞内外渗透压平衡。细胞内外水分的流动速度取决于降温速率。快速降温能缩短细胞的高盐暴露时间，但同时也缩短了细胞内水分渗出时间，大量残留水分最终会在细胞内结冰。胞内冰晶的形成会扰乱细胞正常结构，具有破坏性且可能致其完全丧失功能。而减缓降温速率时，水向外渗出时间充足，胞内残留水份更少，冰晶生成减少。但同时，长时间高盐溶液暴露会导致细胞受损。
2）细胞解冻复温快慢对细胞的影响
过冷环境下升温时，胞内有再次形成冰晶的时间窗口。缓慢升温时，细胞内部、胞外溶液从冰点以下上升到并平衡熔点过程长，冰晶形成时间窗口长，更有利于冰晶形成。相反，复温速度快则冰晶形成时间窗口缩短，抑制冰晶大量生成。简言之，冷冻后的解冻过程中，升温速率越高越好。
3）中间降温速率的确定和适用范围
综合降温冷却及解冻复温两个阶段盐分、冰晶生成的关联，只有采用中间降温速率能保护细胞免受两种损害因素的影响而实现细胞最高存活率。中间降温速率原则不仅适用于酵母菌等，也适用于哺乳动物细胞。中间降温速率是一个大致范围，而非一个绝对值，因细胞类型和溶液组分不同而又差别。譬如，在含1.5M DMSO的保存液中，冷冻绵羊胚胎的冷却速率0.3℃/min [14] 。而肝细胞三维球体则以0.1、0.2及0.3℃/min速率冷却处理均表现出可重复的高解冻后恢复率 [15] 。不过，对于膜通透性较高的细胞类型（如红细胞和精子细胞），在10℃/min或更高速率下冷却时可达到最佳解冻后存活率，实现细胞存活所需的冷冻脱水与毒性规避的关键平衡 [16] 。需注意，无论是马祖尔时代抑或当下，不少实验人员或许听说细胞冷保存的最佳冷却速率应为1℃/分钟的概念。其实，这是有悖于马祖尔中间冷却速率设计指导思想。
总之，低温冷冻保存期间胞内结晶是导致细胞、胚胎死亡的主要原因这一观点，已被包括卢耶特、马祖尔、法希在内的低温生物学界广为接受。如马祖尔观察到，当冰晶体积达到胞内部体积的16%就会导致卵母细胞死亡 [11] 。法希等发现，细胞内部结构被冰晶机械作用破坏是导致肾脏等哺乳动物器官功能丧失的主要原因 [9] 。可以说，学界对细胞内冰形成（intracellular ice formation, IIF)损伤细胞基本上已形成共识。
1.2 冷冻保存相关延迟性细胞死亡说
冷冻保存细胞复苏后细胞死亡可以说是细胞培养实验的常见现象。
将永生化的人T淋巴细胞系Jurkat细胞，通过程控降温仪缓慢冷冻法降温至-50℃的溶液玻璃化转变温度、-40℃非玻璃化温度后，再分别转移到液氮环境下保存。解冻后将各样本细胞初始密度统一调整为7.5±104个细胞/孔，培养24-48-72小时后进行的存活率和代谢活性检测。结果显示，-50℃玻璃化处理的细胞解冻24小时后活性细胞数为8.8±104个细胞/孔，72小时后活性细胞数升至13.1±104个细胞/孔。-40℃非玻璃化处理样品中，解冻24小时后活性细胞数为4.5±107个细胞/孔，48小时后已活性细胞数为4.2±107个细胞/孔，培养72小时内未出现增殖现象。-50℃转移的样本在解冻后48小时和72小时的存活细胞数量、代谢活性值均显著高于非玻璃化处理样品 [17] 。结果表明，悬浮培养的Jurkat细胞因IIF损伤，存在解冻后的前24-72小时课出现持续地、大量细胞数量减损的事实。
但有研究证明，对于融合单层细胞膜，IIF不仅是无害的，甚至一定程度上对细胞具有保护作用。发生IIF情况下，V-79W中国仓鼠成纤维细胞、MDCK细胞培养的单层贴壁细胞或融合单层解冻后细胞存活率有差异：对于单层贴壁细胞，IIF发生导致解冻后的细胞恢复能力有所降低，但存活率依然处于较高水平；而融合单层细胞，则完全免于IIF伤害，甚至在冷却至-40℃时仍表现出高存活率。分析指出，若低温缓慢冷却损伤是源于冷冻与解冻过程中细胞体积的剧烈变化，那细胞内适度的冰晶生成，将有利于消除细胞渗透压失衡，阻止冷却过程中水分子通过质膜外流，反而发挥保护融合单层细胞免受缓慢冷却过程中的IIF损伤的作用 [18] 。类似研究也显示，IIF会对猪角膜内皮细胞（porcine corneal endothelial cells, PCEC）的单层细胞膜造成即时胞膜损伤，但却在解冻培养24小时后膜性维持完好。同样是IIF，人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）的单层细胞膜却未观察到即时性损害，但在解冻后 24 小时的培养期间发生膜的延迟损伤 [19] 。这一方面证实HUVEC 和 PCEC细胞单层对IIF的反应异质性，另外也验证了IIF对细胞损伤效应存在时间滞后性的现象。
在采用标准冷冻保存条件下hES细胞团进行冻融处理后显示，解冻后清洗（5分钟时间点）后，贴壁培养的hES细胞中98%保持活性。然而，当hES细胞团转入37℃恒温箱培养时，细胞活力会随培养时间增加而下降。这种细胞群存活率的急剧下降可被转移到4℃环境下遏制，但再次当恢复至生理温度37℃时，细胞存活率再次呈时间依赖性下降。分析指出，如果hES在冷冻保存期间的死亡是IIF和渗透休克导致，那么细胞膜物理完整性会立即丧失后，可通过台盼蓝染色法可以检测到。这表明，冷冻复苏细胞培养期间出现的细胞活性下降，并非因IIF对细胞结构物理损伤引起 [2] 。
解冻复苏时镜下细胞结构保持完整性的细胞，正常培养期的前72小时内出现的大量坏死的现象，研究人员称之为延迟性细胞死亡（delayed-onset cell death） [20]或冷冻保存诱导的延迟性细胞死亡（cryopreservation-induced delayed-onset cell death, CIDOCD） [21] 。
事实上，大量实验报告中，都可找到冷冻保存细胞的延迟性细胞死亡的痕迹。说明这一现象具有一定普遍性。由于通常在复温后的前24小时内逐渐显现，容易造成人们对特定实验方法中细胞实际恢复率的高估。深入了解与冷冻保存诱导的分子细胞死亡相关的途径与机制，有针对性地开发出可降低延迟性细胞死亡的细胞保存材料和优化冷冻保存策略，对冷冻保存后的高细胞回收率具有重要意义。
纽约州立大学细胞和分子生物家兼BioLife生物技术公司创始人约翰•M•鲍斯特（John M. Baust），从1998年开始关注延迟性细胞死亡现象。多种细胞死亡信号通路的激活往往需要在复苏并转入正常培养数小时至数天才陆续显现。细胞病理性坏死性（解冻后6小时）和基因程序性凋亡（解冻后12小时）具有明显延迟发作特征。而这一过程与细胞冷冻保存后死亡的时间特性相符。因此，鲍斯特指出，传统慢速冷却保存方法保存的MDCK细胞，在解冻后活细胞数量在最初24小时内持续下降，是由于延迟性坏死与凋亡性细胞死亡共同作用所致。解冻后立即出现的caspase活性初始升高（6小时）代表内源性前caspase的募集与激活过程，解冻21小时左右检测到的延迟峰值，是caspase依赖性凋亡信号放大导致转录和翻译水平上调的结果。而通过引入凋亡相关caspase抑制剂，能持续降低延迟死亡，提升解冻后的存活率 [20] 。
在传统细胞冷冻保存液加入单一caspase-1凋亡信号转导途径凋亡抑制剂，解冻后的细胞整体存活率有所提升。但增加caspase-1抑制剂浓度并未带来存活率的额外提升，且其添加未能完全阻断冷冻保存后的细胞凋亡。分析是由于冻融过程中存在多种外源性和内源性凋亡诱导途径造成的。
目前认为，在低温冷冻保存过程中细胞损害机制中，除了冰晶本身对细胞功能结构单元的机械物理损伤、溶液高渗透压（Hyperosomolality）、还存在氧化应激、低温冻伤、CPA毒性等多种诱因。损伤部位包括细胞膜相变（Membrane Phase Transitions）、细胞骨架解体（Cytoskeletal Disassembly）、细胞核和线粒体等器质性损伤，受损生物分子涉及蛋白酶、脂质和核酸，造成细胞内部离子失衡、蛋白质变性（Protein Denaturation）、自由基生成等生物化学过程，从而干扰细胞能量代谢、细胞发育受阻、细胞增殖等生物活动过程，并以细胞延迟性死亡形式加以体现 [22] 。
在我们看来，这一过程所涉及的维度之广、机制之复杂，绝非可以用细胞凋亡信号通路激活理论就能全部概括。应该效仿卢耶特那样，借鉴物理化学定律，从低温保护剂、水分子化学属性与细胞结构与功能间的内在联系入手，似乎更容易接近真相。
二、水的分布与细胞结构和功能的密切联系
细胞内水分子有两种形态，一种是自由水，另一种是结合水。两种形态的水在细胞中各自有其独特生理作用。维持胞内两种形态水的平衡，对于维持细胞生理功能和结构的正常至关重要。
2.1 自由水的分布
自由水即体相水（Bulk water）或称为游离水（Free water），是指没有与细胞组成结构、分子、离子等组分结合的水，可通过渗透、扩散、主动转运等多种机制自由进出细胞膜和细胞器，是细胞养料和代谢废物传输载体，参与酶活性催化、基因表达调控和信号传导等生命活动，还是水解反应、离子水合作用等生化反应的底物。
2.2 结合水的定位
结合水是指分布在蛋白质、核酸或脂质等生物大分子、各种离子结合的水分子层。受离子静电作用、氢键、范德华力、长程库仑力（long-range Coulomb forces）和疏水作用力（hydrophobic forces）等因素节制，这部分水无法自由扩散 [23] 。20世纪50年代发现生物分子结合水存在后, 大量研究证明生物结合水是生命活动中不可或缺的有机组成部分，在维护生物大分子的结构、稳定性以及调控动力学性质和生理功能等方面起着决定性的作用。
生物结合水分为三种类型：（1）溶剂壳（solvation shell），又称溶剂化层，是指在溶质与溶剂间的静电作用、氢键、范德华力等相互作用下，由溶剂分子有序排列包围溶质粒子形成溶剂壳。壳结构通常包括第一溶剂壳层和第二溶剂壳层。第一溶剂壳层由直接与溶质离子配位的溶剂分子组成，而第二溶剂化壳层则包含受溶质离子影响但未直接配位的溶剂分子或离子对。水溶液中形成的是水合壳。细胞内部大量无机离子、生物大分子的荷电基团因静电效应，吸引水分子围绕其周围径向排列，形成与离子或离子基团缔合的水合壳。离带电粒子近的水合层中水分子排列有序，层级向外拓展则水分子排列有序性降低。此外，Na+、Ca2+等小离子则可能嵌入水分子晶格中。（2）生物分子中的极性基团则与水通过氢键相互作用形成极性水合层。（3）非极性基团疏水作用会增强水分子间相互作用，围绕大分子成疏水水合层。在紧密缠绕的分子链间隙中，水分子嵌入形成称为毛细管水的结合水。
与蛋白质结合水分子分为表面水合作用和内部水合作用两种。在蛋白质的表面，水分子会与极性和带电的基团形成氢键或静电相互作用而围绕在蛋白质表面，形成一个动态的水合壳层。研究显示，不同个体、不同类型的细胞，有3%比例的结合水包裹在可溶蛋白质周围，形成厚度相当于一层水分子厚的壳。跟普通的体相水相比，这一水壳内部氢键结构较弱，水分子排列无序程度接近于水蒸汽 [24] 。而蛋白质内部的水分子则通常位于蛋白质结构空腔或裂缝中。因空间维度、孔隙尺寸、界面性质(亲疏水性、刚性柔性等)、外界环境(温度、压力、电场等)的条件限制，生物结合水部分的氢键的数量和结构变化与体系水不同，决定了其不同于体相水的理化特性 [25] 。
蛋白质与水分子形成的氢键网络，推动蛋白质进入折叠状态并维持其二级、三级结构的稳定 [26] 。而疏水作用力驱动着蛋白分子中疏水基团聚集和蛋白质折叠。许多蛋白质分子的构象动态变化与水分子的介入程度有关。蛋白质水合作用必须达到一定程度才能发挥正常功能活性。某些蛋白质空间结构还因水含量不同而异。几个关键靶位结合水分子数的变化，会引起聚赖氨酸及聚谷氨酸等同族多肽的构象发生α→β→γ间的转变。譬如胰岛素，必须在水膜引导下才能形成能降血糖的三维结构。胶原蛋白单螺旋之间的水桥是维持三股螺旋结构的必要条件。蛋白质水合过程，调控着蛋白质离子通道开关、蛋白-蛋白识别、配体和药物结合、酶催化等生物过程 [27] 。
实际上，细胞膜脂膜双层结构、核酸、胞内多糖、脂质等生物大分子和带电粒子，皆因水合作用而维持特定的三维构象和功能活性。
2.3 细胞生命活动对水的调节
蛋白质自身功能活动可调控两种形态水的分布和平衡。超过1/3的真核蛋白质中存在被称为“固有无序区（intrinsically disordered region, IDR）”的特殊结构氨基酸片段。它们与其他具有基因表达调控功能的生物因子间的结合，并非基于传统蛋白间三维构型匹配关系，而是由氨基酸序列的化学性质（如电荷、疏水性等）驱动。研究表明，在低渗环境和/或高温条件下，蛋白质会溶入胞质而暴露出IDR，水分子与IDR的结合后，使局部自由水分子数量减少。相反，在高渗环境和/或低温条件下，蛋白质凝聚，IDR与相应大生物分子结合而并释放所结合的水分子，使细胞内局部自由水分子增加。蛋白质在不同功能活动状态下构象的转换，可调节维持结合水和自由水的平衡以有效应对环境胁迫 [28] 。
生物体内，结合水与自由水会随着环境温度变化、细胞所处环境渗透压和细胞新陈代谢活动水平而相互转换。温度升高，则结合水释放成为自由水，自由水比例的增加，意味着生物体新陈代谢活跃。而温度降低，自由水大量转化为结合水，新陈代谢活动因此而放缓。当自由水含量的异常波动，将造成细胞内两种形态水分布的失衡，可对细胞结构与功能调控产生广泛影响。
三、冷冻保护剂的应用对细胞结构与功能的影响
1965年的美国低温生物学会（Society for Cryobiology）年会上，学者们一致认为，动物细胞在冷冻时需要至少用一种低温保护剂（cryoprotectant）或低温防护剂（ryoprotective agent, CPA）对细胞进行特定处理才能使细胞存活。甘油和二甲基亚砜（DMSO）作为保护剂的发明和使用，是低温生物学技术发展里程的分水岭。
细胞冷冻保存过程中，CPA的保护作用形成机制，一般认为可能与包括氢键调节、细胞膜特性改变、溶液稀释效应及溶液增加粘度等多重因素的协同作用有关 [29] 。
3.1 CPA与水分子间氢键的生成和影响
分子间氢键广泛存在于化学、生物、材料等分子体系中, 在分子识别、维持蛋白质二级和三级折叠构象、DNA螺旋结构形成、分子自组装等方面发挥重要作用。包括甘油、DMSO、乙二醇、PG等小分子膜渗透型CPA，均可通过羟基、甲基或亚砜基等极性基团，与水分子、蛋白、脂质成份形成氢键，改变细胞内部水的氢键网络 [7] 。
羟基(-OH)是参与分子间氢键的重要化学基团之一。乙二醇由两个亚甲基和两个羟基构成，在乙二醇溶液中至少存在两种形式的分子间氢键，一种是水-EG分子间的强氢键相互作用，另一种是EG分子间氢键 [30] 。甘油则能参与6-12个氢键的形成，其与水形成的氢键寿命均长于水-水或甘油分子间的氢键。DMSO分子具有一个亲水的亚硫酰基（极性基团）和两个疏水的甲基（非极性基团），与水之间会产生强偶极-偶极和氢键相互作用。DMSO的亚砜基与水分子形成氢键强度远高于水分子间形成的氢键强度，DMSO-水间氢键寿命水分子间氢键寿命的数倍 [31] 。体相水中氢键网络的动态变化属性，为在相对稀释的CPA溶液中，CPA与水分子间的强大的氢键相互作用替代部分原有水-水氢键网络提供便利，增强了溶液水分子氢键网络结构 [32] 。
而CPA通过氢键吸引水分子生成的溶剂化壳层，则可调节胞内水分子排列和分布。譬如H₂O/DMSO溶液中，微观液–液相分离形成纳米级的DMSO分子簇和水分子团簇。由于DMSO强极性作用，DMSO溶剂壳中对第一溶剂化壳层之外的壳层水分子约束更强，壳体系的结构更稳定，体相水中水分子“被锁定”在DMSO水壳层体系内，胞内体相水份额减少，故可抑制自由水分子簇和四面体网络结构的生成 [33] 。水分子围绕CPA分子的强水合作用，与围绕细胞质膜、蛋白、核酸等细胞成分发生的水合作用存在竞争关系。随着CPA浓度增加，越来越多水分因进入CPA分子的水合层，体相水分子被持续大量消耗，削弱了个细胞组分的水合作用 [34] 。CPA分子极性越强，对水亲和力大，与蛋白等细胞组分间水合作用的竞争中就越有利。吸引胞内组分外围水分子逐步解离流失，胞内自由水、结合水分子重新转移分配，危及细胞膜、细胞器质膜和胞内区室中生物活性大分子正常构象的稳定性。
强极性膜渗透型CPA分子与细胞各组分之间水合作用竞争冲突在细胞内广泛存在，只是不同生物分子、不同功能结构在水合竞争冲突受损程度不同而已。通常，该组分与水分子结合力越弱，越容易受CPA水合作用干扰，功能越容易受损。CPA暴露引发细胞内水份流失，加上CPA水合作用竞争，造成胞内自由水与结合水分布失衡，干扰DNA、蛋白质及其他大分子活性构型，会导致各种细胞器的结构完整性遭受不同轻重不同的损害 [35] 。根据蛋白分子中的IDR序列的分子识别与相互作用机制，我们更有理由相信，CPA干扰了水中氢键网络构象，会对IDR基因表达调控功能带来不利影响。
3.2 CPA对细胞膜功能结构的影响
生物膜是指细胞本身及胞质内叶绿体、细胞核、线粒体、高尔基体、液体泡和内质网等细胞器与外界相隔的双分子层状膜结构，充当着细胞内外环境的屏障，主要成分为磷脂。磷脂是双亲性分子，头部为1个极性亲水头，借助氢键和周围水分子相互作用；尾部为2个脂肪酸链，通过疏水作用彼此接触。不同类型生物膜中脂质、蛋白质的组成比例存在差异，代表了膜功能的多样性。通常，膜和所在细胞器功能越复杂，则蛋白质含量越高；功能越简单，蛋白质含量越低。
磷脂双分子层状膜结构的内外表面都是亲水的，所以在水环境中能稳定存在，借助于膜透性吸收水，还能保持胞内含有适量的水。膜脂的流动性是指膜脂处于液晶态，磷脂脂分子能进行多种运动。膜流动性的维持需适当水合作用与和适宜的温度条件。局部水环境变化导致膜流动性降低，将直接影响跨膜运输功能，损害细胞生理活动。
研究发现，浓度低于≤7.5mol % DMSO水溶液中，DMSO通过将水分子与脂质表面解耦（表面脱水），提高凝胶相DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）模型双层表面的水分子扩散率，将结合的水分子释放到体相水中，降低膜双层间排斥力（包括横向和双层间）的作用范围和强度，应对在冷冻水结晶时对膜结构应变 [36-37] 。当DMSO浓度超过50%（重量体积比）时，DMSO能够破坏层状液晶相的稳定性，降低了分子间的固有排斥力，促使这些磷脂分子更倾向于形成稳定凝胶相。但凝胶相与晶体相稳定化特性或许能解释高浓度DMSO的细胞毒性作用。
DMSO通过降低双层-溶剂界面间的排斥力，有效缩小了双层之间的间距，影响溶质跨生物膜被动渗透作用。溶质跨膜被动渗透动力学关系可用公式J = -Dβ/l(△C)表示。l代表膜厚度，即扩散路径长度。J表示溶质沿浓度梯度方向,即浓度梯度△C递减方向的净通量。D为膜内溶质扩散常数。β是溶质在膜水相与碳氢化合物相间的分配系数。l缩短将有效提升溶质扩散通量。另一个可能受DMSO影响的因素是分配系数。DMSO在界面区域的定位将影响溶质从水相向膜疏水域转移的活化能。极性溶质DMSO从膜界面处溶质中移除水合水分子，可能导致被动扩散的活化能显著降低。
膜渗透型CPA分子对生物膜脂质双层结构、动态及功能的影响的分子动力学模拟研究表明，在乙二醇、丙二醇和甘油等醇类物质存在时，醇类与脂质头基之间的氢键取代了原有的水-脂键，脂质头基发生部分脱水，导致双层膜的横向扩展和变薄。CPA能以浓度依赖方式调控生物膜通透性。体积分数5%浓度的DMSO会降低细胞膜厚度，增加膜的渗透性。在常规使用浓度(10%体积分数）下，DMSO会诱导水孔形成，促使CPA分子取代水分。当DMSO浓度升高至更高且更具毒性的水平(40%体积分数）时，还会破坏磷脂双分子层结构 [38] 。据报道，DMSO会破坏磷脂膜水合作用，破坏细胞膜、核膜、线粒体膜的结构完整性 [39] 。
蛋白质表面上的疏水或氢键相互作用不足以产生寿命超过几纳秒的DMSO−蛋白复合物，因此，低浓度(<10%）一般不会显著影响折叠蛋白的结构或稳定性。水−DMSO混合物的粘度对DMSO含量非常敏感。尤其在稀释区（DMSO摩尔分数为0–0.06，即体积比0–20%），粘度随DMSO含量的增加线性增加超过3倍。DMSO浓度微小变化也会对溶剂粘度产生显著影响，会造成蛋白旋转扩散相关时间发生明显变化 [40] 。膜蛋白旋转时间显著延长，削弱了蛋白的跨膜转运功能。
四、可降低冷冻保存相关细胞延迟性死亡解决方案的探索
4.1 对冷冻保存细胞延迟性死亡中各种诱因的共同本源的分析
冷冻保存相关的细胞延迟性死亡是一个内外因结合诱导的复杂过程，具有多属性（物理性、化学性、器质性和功能性等）、多维度（基因表达、蛋白折叠、复合大分子的组装等）、多靶点（各种细胞器、细胞膜和细胞间连接等）和多路径（能力代谢，发育分化、增值和凋亡等）特点，其中有大量未解之谜。
冰冻与解冻过程中冰晶形成与生长造成的机械损伤，是导致细胞活力丧失主因 [35] 。理由在于：
1）细胞脱水
缓慢冷冻过程中，温度低于平衡冰点后，细胞外水溶液形成冰晶，导致细胞外基质浓度升高。胞外渗透压增加，引发脱水和收缩现象。过度脱水如不可逆，则会损害生物功能。
2）冰晶损伤
无论是慢速冷冻还是快速冷冻过程中，生物材料解冻升温至−15℃到−60℃范围时，处于过冷状态的细胞极易发生“冰晶再结晶”，即游离水转化为冰晶，并随着温度升高冰晶体积增大，会造成细胞二次机械损伤，直接破坏细胞膜和细胞器。
3）渗透胁迫
当温度接近熔点时，大冰晶加速融化成水，胞外空间水溶液由高渗转变为低渗后，胞内高渗胁迫导致水分大量涌入细胞，引发细胞肿胀甚至破裂。
4）氧化应激
在冷冻保存过程中，细胞脱水、高浓度电解质及pH值变化会，促进自由基的产生超氧自由基（O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（OH⁻）等ROS水平升高。而低温削弱内源性抗氧化酶的活性。此外，冰晶破坏细胞膜和细胞器膜结构完整性，造成细胞内成分（如溶酶体酶）外渗，并引发二次氧化反应。而温度骤变会诱导自由基生成，加剧氧化应激。总之，因细胞代谢紊乱及多种酶促反应通路的激活，生成过量活性氧（ROS），通过脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤等方式导致细胞损伤。
鲍斯特认为，冷冻后细胞坏死和凋亡过程，涉及细胞膜、细胞核和线粒体等众多起始位点，与CPA影响到细胞、蛋白质组、基因组的结构有关 [39] 。而肾细胞、成纤维细胞、肝细胞、外周血单核细胞、脐带血、精子、卵母细胞、卵巢组织等大量低温暴露后出现坏死、死亡病理性反应的报道中，只是通过TUNEL实验、流式细胞术等方法检测到与细胞凋亡相关的指征，但诱发凋亡的应激源、发生过程并不清楚。既缺乏对细胞具体损伤部位微观形态、生物化学、信号转导通路等直接证据，也无受损具体基因组靶点、转录组学、蛋白组学层面异常探究结论。因此，冷冻保存相关细胞延迟性死亡，只能作为低温损伤后果而非细胞致死原因。
基于生物学常识，任何细胞膜、细胞器结构完整性受损，功能基因表达、蛋白翻译后修饰及蛋白折叠、及生物分子之间相互作用的异常，都可能引发细胞功能的紊乱甚至死亡。冰晶在细胞内部三维空间恣意生长，受损细胞器岂止是已见报道的细胞膜、线粒体、细胞核？答案显然是否定的。冰晶对细胞膜机械损伤破坏胞膜完整性，不同程度的氧化应激、渗透应激反应造成细胞结构功能损伤甚至细胞凋亡，的确可认定为因果关联。目前，不仅渗透应激、氧化应激与细胞凋亡间确切联系机制不明，应激反应初始诱因也未见提及。而这形同一面镜子，既可让你从中一窥生命科学前行的缩影，又能直面这一领域探索步履的蹒跚。
如前所述，现有的小分子膜渗透型CPA分子，如DMSO，与水分子形成强大氢键，将改变体相水内部氢键网络结构。CPA分子或分子簇通过水合作用形成溶剂化壳层，与胞内各组分、粒子的水合作用间存在自由水分子的竞争，影响胞内结合水-自由水的分配分布。
DSMO利用自身双性亲和力，在胞内扩散后，可以直接与蛋白、脂质相互作用，造成生物大分子表面结合、内部疏水基团周围的水分子解构，胞内区室局部组分出现脱水是完全可能。脱水波及范围和程度则与CPA浓度有关。考虑到不同细胞器生理功能不同，不同区室生物膜化学组成、膜流动性、膜蛋白组成差异，与CPA分子亲和力有别，膜结构与功能对CPA干扰的耐受程度不同。CPA与细胞各生物活性组分间相互作用应是非特异性而广泛的，而且具有细胞类型异、发育阶段和功能活动状态的异质性特点。
CPA与水分子间强大而稳定的氢键网络、水合作用竞争关系、CPA与细胞组分相互作用的广泛性，正好将整个胞内组分在冷冻保存期间发生的物理化学变化紧密连接。譬如：体相水粘度对DSMO浓度高度敏感性、CPA-水分子氢键结构，可以解释胞内冰晶生成抑制效应；CPA与水的相互作用干扰到IDR结构域疏水作用后，造成细胞基因表达调控的紊乱；细胞与CPA分子相互作用，可造成膜的脱水、流动性、通透性改变，甚至引发膜穿孔，将造成线粒体、溶酶体、内质网、核糖体质膜损坏，氧自由基泄露，胞内生物大分子合成及代谢失常，可危及细胞一种或多种生物功能通路。
因此，站在物理化学角度，从CPA——水分子分布——细胞组分形态与功能三者间的内在联系，来理解细胞冷冻过程死亡，似乎更为合理。
4.2 低温生物学经典理论所指引的细胞冷冻保存死亡解决出路
卢耶特提出的玻璃化技术，利用物理学的非晶态转变原理将体相水中自由水分子的运动加以束缚，限制水分子间的聚集，实现对细胞内晶核和冰晶形成有效控制的目的。本质上，使用物理学降温方法将水分子热运动加以约束，阻碍水分子聚合结成冰晶。只要CCR够高，样品体积够小，就可实现玻璃化转变。细胞内部体相水脱水，在这并非首要条件。舍去细胞脱水环节的好处在于，胞内各生物膜、生物分子组分“各得其所(水)”，构型和功能活性得以保持，渗透压应激也就无从谈起。但玻璃化转变对应的临界冷却速率（critical cooling rate, CCR)高达每秒数百摄氏度。已远超Thermo CryoMed TSCM17SV、贝纳吉CX17等液氮程序降温仪（最高降温速率99.9℃/min）及Grant CRFT等液氦斯特林制冷程控降温仪（最高降温速率10℃/min）的降温速率极限。假设：1mL液体薄层采用液氦制冷，从4℃降至-269℃耗时仅1秒，则降温速率为273℃/秒，几近乎常规实验条件下降温技术能力极限。因此，靠单一物理降温手段实现液体玻璃化理念，不仅卢耶特那个年代还是当下，都难以施行。
卢耶特的经典玻璃化理念给我们的启示在于，少打细胞脱水的主意，多动脑筋综合物理、化学手段，降低胞外溶液冰晶成核温度至-40℃左右，同时提升材料的玻璃化转变温度至-60℃附件，有利于用液氮降温处理快速完成玻璃化转变，将水分子束缚以限制其自由扩散。
马祖尔中间降温速率方法中，通过在细胞保存液中添加适当盐分提高溶液渗透压后，细胞脱水而使体相水存量极大减少，内容物变得粘稠，水分子聚合受限，也就抑制了冰晶形成。低中间降温速率，可使护细胞免于高盐与冰晶的暴露损害，实现细胞高存活率。在新一代革命性CPA制剂发明应用前，马祖尔提出中间冷却速率依然具有重要指导意义。
不考虑细胞类型和细胞体积大小，盲目照搬细胞保存液配方和降温速率条件，有可能造成保存失败。据报道，传统哺乳动物细胞储存方法应用于非终末分化细胞经常被证明无效 [39] 。将缓慢冷冻或悬浮培养细胞团的玻璃化冷冻法用于人类胚胎干细胞（hES）冷冻保存，解冻后出现高比例细胞死亡及自发分化现象 [41] 。传统玻璃化保存方法中含10% DMSO配方保存液，对小鼠胚胎干细胞冷冻保存有效，但用于hESC存在细胞死亡率高、生长缓慢及分化过度等问题 [42] 。针对细胞胞膜、胞质、细胞器化学组分含量差异，优化包括CPA在内的冷冻保存溶液配方，才是提高细胞的回收率和恢复率的正道。
站在今天的角度看，由于细胞内容物蛋白等大分子含量高，较为粘稠，成核温度较胞外溶液低。在细胞溶液中添加适量的非膜渗透型CPA制剂，提高溶液的粘稠度、降低溶液成核温度，可减轻细胞渗透脱水程度。筛选可与膜双层结构脂质分子、蛋白分子的弱相互作用，维持生物膜结构的稳定性，保护生物膜，就可确保细胞内部生理环境相对稳定。添加膜渗透型弱极性惰性粒子或小分子天然化合物，增加体相水粘度，增加胞内体系粘度以限制水分子运动，降低胞内体系成核温度，同时不会对细胞组分产生毒性作用，采用液氮降温法实现250μL-1.0mL体积细胞样品无冰玻璃化冷冻保存，即可有效改善常规冷冻保存中细胞高死亡率问题。
4.3 通过功能性细胞保存溶液开发解决细胞延迟性死亡思路存在的弊端
不同细胞类型出现冷冻保存后细胞延迟死亡，具有各自独特生化通路特征。有学者指出，冷冻保存的生化干预方案应根据组织特异性，调控生化通路而非单纯优化冷冻保存流程，可提升生物材料解冻后的存活率 [29] 。通常，样品保存材料除添加适量CPA中来控制冰晶形成之外，将包括自由基清除剂、离子螯合剂、蛋白酶抑制剂以及靶向细胞凋亡级联反应的半胱天冬酶抑制剂和Rho激酶（ROCK）抑制剂等化合物添加到保存溶液或解冻后培养基中，被证明可减少人多能干细胞冷冻保存诱导的细胞凋亡 [43] 。譬如，在MDCK细胞的冷冻保存液中添加10µM单位的半胱天冬酶-1抑制剂V（Z-VAD-FMK)，显示解冻后存活细胞比例提升10% [20] 。鉴于人类间充质干细胞（MSCs）冷冻保存过程中不仅激活了细胞内源性（线粒体）和外源性（死亡受体）信号通路，同时还触发钙蛋白酶级联反应，故使用广谱抑制剂Z-VAD-FMK比选采用择性半胱天冬酶抑制剂处理细胞获得更高细胞存活率 [44] 。
hES作为“社会性”协同作用细胞，对细胞间隙连接及细胞间黏附接触的任何损伤都十分敏感。连续传代过程中若将hES集落解离为单个细胞或含<10个细胞簇，会严重损害体外hES存活与增殖。故所有培养方案中，都特别注意确保hES集落在连续传代过程中被温和解离成相对较大的细胞团块。有证据表明，100个细胞大小的细胞团块，最有利于hES集落生长扩增 [2] 。因此，传统冷冻保存方法用常规慢冻-快融技术处理胰酶消化后的单细胞不适用于这类干细胞。但在冷冻培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632，解离为较小细胞团块（降低细胞团体积，提高降温速度和均匀性）后冷冻保存后同样可保持较高存活率，但无法提高克隆效率。如在解冻后培养基中也添加Y-27632，则可显著促进hESC集落形成。研究还显示，在冷冻解离前及解冻后两个阶段都加载Y-27632，可实现集落形成效率最大化，显示出协调作用 [42] 。
类似策略还可拓展到其他生物通路的调控领域。例如通过靶向应用抗氧化剂来降低氧化损伤。抗氧化活性的硒有机化合物Ebselen可模拟谷胱甘肽过氧化物酶的作用，减少保存过程中的细胞损伤。SUL-10通过保留线粒体网络结构和激活线粒体复合物I和IV 来保护细胞，从而维持ATP的产生并防止ROS的形成。这些化合物可以直接添加到细胞培养基中用作细胞保存溶液。
有学者提出，一款成功的细胞冷冻保存溶液制剂的设计还应包括电解质（如Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Cl-，以抵消离子失衡），至少一种单糖（如葡萄糖，作为能量来源），低温条件下有效的生物pH缓冲液（如HEPES）和有效的抗阻剂（如蔗糖或甘露醇）来抵消冷暴露期间细胞肿胀程度 [45] 。
基于凋亡激活通路机制、生化通路不完整认识框架上，通过添加名目繁多的各种保护性功能制剂提高冷冻细胞存活率的途径，是一条看不到尽头的漫长征途。这种无休止地积木式做法，仅仅考虑了冻伤双因素假说中的保存溶液溶质这一个方面，升级溶液配方的同时如不同步验证、优化降温速率优化，注定这类保存溶液所适用细胞类型的局限性，对于组织器官、类器官保存并无特殊优势。而日益复杂的制剂配方，不仅增加开发和质控成本，也给使用者带来日益繁重的经费开支负担。
4.4 创新CPA运用方案对减少冷冻保存有关细胞死亡的技术可行性
细胞类型和细胞密度的多样性以及组成细胞之间的形态尺寸差异，决定着组织和器官的独特物理特性，进而影响样品对冷冻和解冻的生物学反应。此外，组织中细胞-细胞和细胞-基质相互作用，也影响到冷冻后细胞存活率差 [35] 。
在大体积组织、类器官或器官内部紧密的细胞间连接和三维结构，使CPA难以充分渗透进入组织的内部。生物组织导热系数相对较低，受因热传递和传质限制，组织内极易出现温度梯度差。组织外表与核心因温差而造成收缩差异。收缩引起应力会导致组织断裂 [45] 。因此，对于类器官等大体积组织样品，冷却/解冻速率有其特殊意义。根据双因素假说，无论何种类型细胞，要实现最佳回收率，从保存溶液配方、冷却复苏变温速率两个方面同时优化至关重要。下面这两则类器官保存成功案例便是明证。
1）人脂肪源间充质干细胞组织球体玻璃化冷冻保存方法 [46]
研究目的：用人脂肪源间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) ，经平衡液、玻璃化液两步处理后用玻璃化保存方法，对单细胞MSC、三维MSC球体进行毒理观测。
平衡液CPA配方：以DPBS缓冲液为基础，添加20%（体积比）胎牛血清、1.4M DMSO和EG；
玻璃化液CPA配方：将LM5载体溶液中葡萄糖、甘露醇和乳糖替换为0.3 M蔗糖，添加2.8M DMSO、2.7M EG、2.8 M甲酰胺和70 g/L PVP K12而成；
类器官三维球体生成方法：将第5代MSC接种于25μL悬滴法培养基中，每滴含104-105个细胞，用MSC培养基37℃、5% CO2湿润环境中培养7天，用尼康倒置显微镜观察MSC球体形成情况。
类器官球体玻璃化处理流程：球体按10个/管的密度悬浮后转移至1.5mL冷冻管，先在平衡液中悬浮10分钟，再与玻璃化液混合1分钟后，立即直接浸入液氮中保存备用。两周后将冻存管置于37℃水浴中快速解冻，解冻细胞依次用含20%胎牛血清的DPBS梯度缓冲溶液（含0.5M、0.25M和0M蔗糖）分别悬浮5分钟后，转入培养基进行正常培养。
研究结果：使用高浓度的CPA对单细胞和球体进行玻璃化处理，经冷冻保存复温后，类器官组织及单细胞存活率高，无细胞毒性。
2）人肾脏类器官玻璃化冷冻保存方法 [47]
人肾单位祖细胞诱导分化人类多能干细胞（hPSC）构建的肾脏类器官的玻璃化冷冻保存研究实验中，类器官样本先经室温下浸泡于平衡溶液中8-15分钟后，立即转移至含200μL玻璃化溶液的冻存管中处理10秒钟。染色将冻存管立即浸入液氮中启动玻璃化程序。最后所有类器官样品管转入-150℃深低温冰箱储存7天。
平衡溶液CPA配方：10% DMSO和10% EG混合而成。
玻璃化冷冻液CPA配方：含由20% DMSO、20% EG和0.75M蔗糖配制而成。
三步升温解冻复苏液配方：类器官依次在含RPMI培养基配制的0.5 M蔗糖溶液（3分钟）、0.25 M蔗糖溶液（3分钟）、0.125 M蔗糖溶液（2分钟）的微量管中孵育完成渐进式升温过程。最后收集类器官，转移至96孔板培养基中完成解冻后的培养阶段中持续存活和生长。解冻7天后对类器官的存活率、功能性和结构完整性的评估。
实验结果：玻璃化冷冻技术存活率91%（接近照组达99.4%水平），类器官显示出完整的近端和远端小管，带有 LTL 和 CDH1 细胞。簇状足细胞结构的保存，表现出正常生长。
上述两例关于类器官冷冻保存成功案例中，都沿用了常规玻璃化冷冻保存流程，都在保存溶剂中采用了CPA组合策略。如平衡液中都采用了低浓度DSMO+EG组合方案，玻璃化溶液中DSMO+EG两种膜渗透型CPA的浓度翻倍，还添加了蔗糖这种经济型膜渗透型CPA。
除了将传统CPA制剂组合运用外，毒性低、生物相容性好的新型化合物CPA的开发应用，是目前学界关注的研究热点之一，因《冷冻保护剂在细胞低温保存技术中的应用》一文已有讨论，故不再赘述。
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