零丁洋里叹零丁——从冷冻保护剂的化学特性看细胞延迟性死亡的应对策略-下

四、可降低冷冻保存相关细胞延迟性死亡解决方案的探索

4.1 对冷冻保存细胞延迟性死亡中各种诱因的共同本源的分析

       冷冻保存相关的细胞延迟性死亡是一个内外因结合诱导的复杂过程，具有多属性（物理性、化学性、器质性和功能性等）、多维度（基因表达、蛋白折叠、复合大分子的组装等）、多靶点（各种细胞器、细胞膜和细胞间连接等）和多路径（能力代谢，发育分化、增值和凋亡等）特点，其中有大量未解之谜。

       冰冻与解冻过程中冰晶形成与生长造成的机械损伤，是导致细胞活力丧失主因 ^[3] 。理由在于：

       1）细胞脱水：

       缓慢冷冻过程中，温度低于平衡冰点后，细胞外水溶液形成冰晶，导致细胞外基质浓度升高。胞外渗透压增加，引发脱水和收缩现象。过度脱水如不可逆，则会损害生物功能。

       2）冰晶损伤：

       无论是慢速冷冻还是快速冷冻过程中，生物材料解冻升温至−15℃到−60℃范围时，处于过冷状态的细胞极易发生“冰晶再结晶”，即游离水转化为冰晶，并随着温度升高冰晶体积增大，会造成细胞二次机械损伤，直接破坏细胞膜和细胞器。

       3）渗透胁迫：

       当温度接近熔点时，大冰晶加速融化成水，胞外空间水溶液由高渗转变为低渗后，胞内高渗胁迫导致水分大量涌入细胞，引发细胞肿胀甚至破裂。

       4）氧化应激：

       在冷冻保存过程中，细胞脱水、高浓度电解质及pH值变化会，促进自由基的产生超氧自由基（O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（OH⁻）等ROS水平升高。而低温削弱内源性抗氧化酶的活性。此外，冰晶破坏细胞膜和细胞器膜结构完整性，造成细胞内成分（如溶酶体酶）外渗，并引发二次氧化反应。而温度骤变会诱导自由基生成，加剧氧化应激。总之，因细胞代谢紊乱及多种酶促反应通路的激活，生成过量活性氧（ROS），通过脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤等方式导致细胞损伤。

       鲍斯特认为，冷冻后细胞坏死和凋亡过程，涉及细胞膜、细胞核和线粒体等众多起始位点，与CPA影响到细胞、蛋白质组、基因组的结构有关 ^[45] 。而肾细胞、成纤维细胞、肝细胞、外周血单核细胞、脐带血、精子、卵母细胞、卵巢组织等大量低温暴露后出现坏死、死亡病理性反应的报道中，只是通过TUNEL实验、流式细胞术等方法检测到与细胞凋亡相关的指征，但诱发凋亡的应激源、发生过程并不清楚。既缺乏对细胞具体损伤部位微观形态、生物化学、信号转导通路等直接证据，也无受损具体基因组靶点、转录组学、蛋白组学层面异常探究结论。因此，冷冻保存相关细胞延迟性死亡，只能作为低温损伤后果而非细胞致死原因。

       基于生物学常识，任何细胞膜、细胞器结构完整性受损，功能基因表达、蛋白翻译后修饰及蛋白折叠、及生物分子之间相互作用的异常，都可能引发细胞功能的紊乱甚至死亡。冰晶在细胞内部三维空间恣意生长，受损细胞器岂止是已见报道的细胞膜、线粒体、细胞核？答案显然是否定的。冰晶对细胞膜机械损伤破坏胞膜完整性，不同程度的氧化应激、渗透应激反应造成细胞结构功能损伤甚至细胞凋亡，的确可认定为因果关联。目前，不仅渗透应激、氧化应激与细胞凋亡间确切联系机制不明，应激反应初始诱因也未见提及。而这形同一面镜子，既可让你从中一窥生命科学前行的缩影，又能直面这一领域探索步履的蹒跚。

       如前所述，现有的小分子膜渗透型CPA分子，如DMSO，与水分子形成强大氢键，将改变体相水内部氢键网络结构。CPA分子或分子簇通过水合作用形成溶剂化壳层，与胞内各组分、粒子的水合作用间存在自由水分子的竞争，影响胞内结合水-自由水的分配分布。

       DSMO利用自身双性亲和力，在胞内扩散后，可以直接与蛋白、脂质相互作用，造成生物大分子表面结合、内部疏水基团周围的水分子解构，胞内区室局部组分出现脱水是完全可能。脱水波及范围和程度则与CPA浓度有关。考虑到不同细胞器生理功能不同，不同区室生物膜化学组成、膜流动性、膜蛋白组成差异，与CPA分子亲和力有别，膜结构与功能对CPA干扰的耐受程度不同。CPA与细胞各生物活性组分间相互作用应是非特异性而广泛的，而且具有细胞类型异、发育阶段和功能活动状态的异质性特点。

       CPA，特别是膜穿透型小分子CPA，凭借与水分子间形成的强大而稳定的氢键网络、水合作用竞争优势、与细胞组分相互作用的广泛性，正好将整个胞内组分在冷冻保存期间发生的物理化学变化紧密连接。譬如：体相水粘度对DSMO浓度高度敏感性、CPA-水分子氢键结构，可以解释胞内冰晶生成抑制效应；CPA与水的相互作用干扰到IDR结构域疏水作用后，造成细胞基因表达调控的紊乱；细胞与CPA分子相互作用，可造成膜的脱水、流动性、通透性改变，甚至引发膜穿孔，将造成线粒体、溶酶体、内质网、核糖体质膜损坏，氧自由基泄露，胞内生物大分子合成及代谢失常，可危及细胞一种或多种生物功能通路。

       法伊1990年就曾指出在，CPA与细胞内不同区域活性成分和功能结构的多重相互作用，干扰包括细胞酶促反应、膜转运机制和离子交换等在内的生物过程，可引发细胞糖酵解能量生成缺陷、氧消耗异常以及电解质平衡紊乱而造成细胞损伤 ^[47] 。即使低剂量DMSO也可能诱导细胞凋亡和不受控的分化 ^[48] 。

       因此，站在物理化学角度，从CPA——水分子分布——细胞组分形态与功能三者间的内在联系，来理解细胞冷冻过程死亡，似乎更为合理。

4.2 低温生物学经典理论所指引的细胞冷冻保存死亡解决出路

       卢耶特提出的玻璃化技术，利用物理学的非晶态转变原理将体相水中自由水分子的运动加以束缚，限制水分子间的聚集，实现对细胞内晶核和冰晶形成有效控制的目的。本质上，使用物理学降温方法将水分子热运动加以约束，阻碍水分子聚合结成冰晶。只要CCR够高，样品体积够小，就可实现玻璃化转变。细胞内部体相水脱水，在这并非首要条件。舍去细胞脱水环节的好处在于，胞内各生物膜、生物分子组分“各得其所(水)”，构型和功能活性得以保持，渗透压应激也就无从谈起。但玻璃化转变对应的临界冷却速率（critical cooling rate, CCR)高达每秒数百摄氏度。已远超Thermo CryoMed TSCM17SV、贝纳吉CX17等液氮程序降温仪（最高降温速率99.9℃/min）及Grant CRFT等液氦斯特林制冷程控降温仪（最高降温速率10℃/min）的降温速率极限。假设：1mL液体薄层采用液氦制冷，从4℃降至-269℃耗时仅1秒，则降温速率为273℃/秒，几近乎常规实验条件下降温技术能力极限。因此，靠单一物理降温手段实现液体玻璃化理念，即便是当下，常规处理方法都难以有效施行。

       卢耶特的经典玻璃化理念给我们的启示在于，少打细胞脱水的主意，多动脑筋综合物理、化学手段，降低胞外溶液冰晶成核温度，同时提升材料的玻璃化转变温度，缩小过冷溶液与玻璃化转变温差范围，将有利于用液氮降温处理快速完成玻璃化转变，将水分子束缚，限制其自由积聚。

       马祖尔中等冷却速率方法中，通过在细胞保存液中添加适当盐分提高溶液渗透压后，细胞脱水而使体相水存量极大减少，内容物变得粘稠，水分子聚合受限，也就抑制了冰晶形成。低中等冷却速率，可使护细胞免于高盐与冰晶的暴露损害，实现细胞高存活率。在新一代革命性CPA制剂发明应用前，马祖尔提出中间冷却速率依然具有重要指导意义。

       不考虑细胞类型和细胞体积大小，盲目照搬细胞保存液配方和降温速率条件，有可能造成保存失败。据报道，传统哺乳动物细胞储存方法应用于非终末分化细胞经常被证明无效 ^[45] 。将缓慢冷冻或悬浮培养细胞团的玻璃化冷冻法用于人类胚胎干细胞（hES）冷冻保存，解冻后出现高比例细胞死亡及自发分化现象 [^49] 。传统玻璃化保存方法中含10% DMSO配方保存液，对小鼠胚胎干细胞冷冻保存有效，但用于hESC存在细胞死亡率高、生长缓慢及分化过度等问题 ^[50] 。针对细胞胞膜、胞质、细胞器化学组分含量差异，优化包括CPA在内的冷冻保存溶液配方，才是提高细胞的回收率和恢复率的正道。

       站在今天的角度看，由于细胞内容物蛋白等大分子含量高，较为粘稠，成核温度较胞外溶液低。在细胞溶液中添加适量的非膜渗透型CPA制剂，提高溶液的粘稠度、降低溶液成核温度，可减轻细胞渗透脱水程度。筛选可与膜双层结构脂质分子、蛋白分子的弱相互作用，维持生物膜结构的稳定性，保护生物膜，就可确保细胞内部生理环境相对稳定。添加膜渗透型弱极性惰性粒子或小分子天然化合物，增加体相水粘度，增加胞内体系粘度以限制水分子运动，降低胞内体系成核温度，同时不会对细胞组分产生毒性作用，采用液氮降温法实现250μL-1.0mL体积细胞样品无冰玻璃化冷冻保存，即可有效改善常规冷冻保存中细胞高死亡率问题。

4.3 通过功能性细胞保存溶液开发解决细胞延迟性死亡思路存在的弊端

       不同细胞类型出现冷冻保存后细胞延迟死亡，具有各自独特生化通路特征。有学者指出，冷冻保存的生化干预方案应根据组织特异性，调控生化通路而非单纯优化冷冻保存流程，可提升生物材料解冻后的存活率 ^[6] 。通常，样品保存材料除添加适量CPA中来控制冰晶形成之外，将包括自由基清除剂、离子螯合剂、蛋白酶抑制剂以及靶向细胞凋亡级联反应的半胱天冬酶抑制剂和Rho激酶（ROCK）抑制剂等化合物添加到保存溶液或解冻后培养基中，被证明可减少人多能干细胞冷冻保存诱导的细胞凋亡 ^[51] 。譬如，在MDCK细胞的冷冻保存液中添加10µM单位的半胱天冬酶-1抑制剂V（Z-VAD-FMK)，显示解冻后存活细胞比例提升10% ^[27] 。鉴于人类间充质干细胞（MSCs）冷冻保存过程中不仅激活了细胞内源性（线粒体）和外源性（死亡受体）信号通路，同时还触发钙蛋白酶级联反应，故使用广谱抑制剂Z-VAD-FMK比选采用择性半胱天冬酶抑制剂处理细胞获得更高细胞存活率 ^[52] 。

       hES作为“社会性”协同作用细胞，对细胞间隙连接及细胞间黏附接触的任何损伤都十分敏感。连续传代过程中若将hES集落解离为单个细胞或含<10个细胞簇，会严重损害体外hES存活与增殖。故所有培养方案中，都特别注意确保hES集落在连续传代过程中被温和解离成相对较大的细胞团块。有证据表明，100个细胞大小的细胞团块，最有利于hES集落生长扩增 ^[8] 。因此，传统冷冻保存方法用常规慢冻-快融技术处理胰酶消化后的单细胞不适用于这类干细胞。但在冷冻培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632，解离为较小细胞团块（降低细胞团体积，提高降温速度和均匀性）后冷冻保存后同样可保持较高存活率，但无法提高克隆效率。如在解冻后培养基中也添加Y-27632，则可显著促进hESC集落形成。研究还显示，在冷冻解离前及解冻后两个阶段都加载Y-27632，可实现集落形成效率最大化，显示出协调作用 ^[50] 。

       类似策略还可拓展到其他生物通路的调控领域。例如通过靶向应用抗氧化剂来降低氧化损伤。如传统强效抗氧化剂褪黑素（Melatonin, MLT），新型有机化合物Ebselen（可模拟谷胱甘肽过氧化物酶的作用），SUL-10（通过保留线粒体网络结构和激活线粒体复合物I和IV而维持ATP的产生并防止ROS的形成）以及软骨组织中的抗坏血酸、硫酸软骨素等特化细胞与组织的关键成分等。这些化合物可以直接添加到细胞培养基中用作细胞保存溶液，能保护细胞膜完整性 ^[48] 。

       甚至有人提出，一款成功的细胞冷冻保存溶液制剂的设计还应包括电解质（如Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Cl-，以抵消离子失衡），至少一种单糖（如葡萄糖，作为能量来源），低温条件下有效的生物pH缓冲液（如HEPES）和有效的抗阻剂（如蔗糖或甘露醇）来抵消冷暴露期间细胞肿胀程度 ^[53] 。

       基于凋亡激活通路机制、生化通路不完整认识框架上，通过添加名目繁多的各种保护性功能制剂提高冷冻细胞存活率的途径，是一条看不到尽头的漫长征途。这种无休止地积木式做法，仅仅考虑了冻伤双因素假说中的保存溶液溶质这一个方面，升级溶液配方的同时如不同步验证、优化降温速率优化，注定这类保存溶液所适用细胞类型的局限性，对于组织器官、类器官保存并无特殊优势。而日益复杂的制剂配方，不仅增加开发和质控成本，也给使用者带来日益繁重的经费开支负担。

4.4 创新CPA运用方案对减少冷冻保存有关细胞死亡的技术可行性

       细胞类型和细胞密度的多样性以及组成细胞之间的形态尺寸差异，决定着组织和器官的独特物理特性，进而影响样品对冷冻和解冻的生物学反应。此外，组织中细胞-细胞和细胞-基质相互作用，也影响到冷冻后细胞存活率差 ^[3] 。

       在大体积组织、类器官或器官内部紧密的细胞间连接和三维结构，使CPA难以充分渗透进入组织的内部。生物组织导热系数相对较低，受因热传递和传质限制，组织内极易出现温度梯度差。组织外表与核心因温差而造成收缩差异，而收缩引起应力会导致组织内部断裂 ^[53] 。因此，对于类器官等大体积组织样品，冷却/解冻速率有其特殊意义。根据马祖尔中等冷却速度原则，无论何种类型细胞，要实现最佳回收率，从保存溶液配方、冷却复苏变温速率两个方面同时优化至关重要。下面这两则类器官保存案例便是明证。

1）人脂肪源间充质干细胞组织球体玻璃化冷冻保存方法 ^[54]

       研究目的：用人脂肪源间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC) ，经平衡液、玻璃化液两步处理后用玻璃化保存方法，对单细胞MSC、三维MSC球体进行毒理观测。

       平衡液CPA配方：以DPBS缓冲液为基础，添加20%（体积比）胎牛血清、1.4M DMSO和EG；

       玻璃化液CPA配方：将LM5载体溶液中葡萄糖、甘露醇和乳糖替换为0.3 M蔗糖，添加2.8M DMSO、2.7M EG、2.8 M甲酰胺和70 g/L PVP K12而成；

       类器官三维球体生成方法：将第5代MSC接种于25μL悬滴法培养基中，每滴含104-105个细胞，用MSC培养基37℃、5% CO2湿润环境中培养7天，用尼康倒置显微镜观察MSC球体形成情况。

       类器官球体玻璃化处理流程：球体按10个/管的密度悬浮后转移至1.5mL冷冻管，先在平衡液中悬浮10分钟，再与玻璃化液混合1分钟后，立即直接浸入液氮中保存备用。两周后将冻存管置于37℃水浴中快速解冻，解冻细胞依次用含20%胎牛血清的DPBS梯度缓冲溶液（含0.5M、0.25M和0M蔗糖）分别悬浮5分钟后，转入培养基进行正常培养。

       研究结果：使用高浓度的CPA对单细胞和球体进行玻璃化处理，经冷冻保存复温后，类器官组织及单细胞存活率高，无细胞毒性。

2）人肾脏类器官玻璃化冷冻保存方法 ^[55]

       人肾单位祖细胞诱导分化人类多能干细胞（hPSC）构建的肾脏类器官的玻璃化冷冻保存研究实验中，类器官样本先经室温下浸泡于平衡溶液中8-15分钟后，立即转移至含200μL玻璃化溶液的冻存管中处理10秒钟。染色将冻存管立即浸入液氮中启动玻璃化程序。最后所有类器官样品管转入-150℃深低温冰箱储存7天。

       平衡溶液CPA配方：10% DMSO和10% EG混合而成。

       玻璃化冷冻液CPA配方：含由20% DMSO、20% EG和0.75M蔗糖配制而成。

       三步升温解冻复苏液配方：类器官依次在含RPMI培养基配制的0.5 M蔗糖溶液（3分钟）、0.25 M蔗糖溶液（3分钟）、0.125 M蔗糖溶液（2分钟）的微量管中孵育完成渐进式升温过程。最后收集类器官，转移至96孔板培养基中完成解冻后的培养阶段中持续存活和生长。解冻7天后对类器官的存活率、功能性和结构完整性的评估。

       实验结果：玻璃化冷冻技术存活率91%（接近照组达99.4%水平），类器官显示出完整的近端和远端小管，带有 LTL 和 CDH1 细胞。簇状足细胞结构的保存，表现出正常生长。

       上述两例类器官保存案例中，用的都是玻璃化冷冻保存方法，在玻璃化保存溶剂中都采用了CPA组合的鸡尾酒策略：平衡液中用低浓度DSMO+EG组合方案，玻璃化溶液中DSMO+EG两种膜渗透型CPA的浓度翻倍，还添加了廉价的非膜渗透性CPA蔗糖，未添加抗氧化剂、抗凋亡试剂。

       除了将传统CPA制剂组合运用外，毒性低、生物相容性好的新型化合物CPA的开发应用，是目前学界关注的研究热点之一，《冷冻保护剂在细胞低温保存技术中的应用》一文已有讨论，此处不再赘述。

参考文献

[1]  Campbell L, Betsou F, Leiolani D, et al. 2012 ISBER Best Practices for Repositories: Collection, Storage, Retrieval, and Distribution of Biological Materials for Research. Biopreserv Biobank. 2012;10:81–161.

[2]  Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol. 1984;247:125–142.

[3]  Miaorong Huang, Minhua Hu, Gengyuan Cai, et al. Overcoming ice: cutting-edge materials and advanced strategies for effective cryopreservation of biosample. J Nanobiotechnology. 2025; 23: 187.

[4]  Gary N Clarke, De Yi Liu, H W Gordon Baker. Recovery of human sperm motility and ability to interact with the human zona pellucida after more than 28 years of storage in liquid nitrogen. Fertil Steril. 2006 Sep;86(3):721-2.

[5]  V Mirabet, C Carda, P Solves, E Novella-Maestre, et al. Long-term storage in liquid nitrogen does not affect cell viability in cardiac valve allografts. Cryobiology. 2008 Oct;57(2):113-21.

[6]  Kathryn A. Murray, Matthew I. Gibson. Chemical approaches to cryopreservation. Nat Rev Chem. 2022; 6(8): 579–593.

[7]  Michael J. Taylor, Bradley P. Weegman, Simona C. Baicu, et al. New Approaches to Cryopreservation of Cells, Tissues, and Organs. Transfus Med Hemother. 2019; 46(3): 197–215.

[8]  Boon Chin Heng, Chao Peng Ye, Hua Liu, et al. Loss of viability during freeze–thaw of intact and adherent human embryonic stem cells with conventional slow-cooling protocols is predominantly due to apoptosis rather than cellular necrosis. J. Biomed. Sci. 2006; 13:433–445.

[9]  Zongqi Guo, Nikolas Zuchowicz, Jessica Bouwmeester, et al. Conduction‐Dominated Cryomesh for Organism Vitrification. Adv Sci (Weinh) 2024 Jan; 11(3): 2303317.

[10]  Li Zhan, Joseph Sushil Rao, Nikhil Sethia, et al. Pancreatic islet cryopreservation by vitrification achieves high viability, function, recovery and clinical scalability for transplantation. Nat Med. 2022; 28(4):798-808.

[11]  Zonghu Han, Anirudh Sharma, Zhe Gao, et al. Diffusion Limited Cryopreservation of Tissue with Radiofrequency Heated Metal Forms. Adv Healthc Mater. 2020 Oct; 9(19): e2000796.

[12]  Paul J. Schmidt. Basile J. Luyet and the Beginnings of Transfusion Cryobiology. Transfusion Medicine Reviews. 2006; 20(3):242-246.

[13]  T. Meryman. Basile J. Luyet: In memoriam. Cryobiology. 1975; 12(4):285-292.

[14]  Pierre Vanderzwalmen, Fabien Ectors, Yannis Panagiotidis, et al. The Evolution of the Cryopreservation Techniques in Reproductive Medicine—Exploring the Character of the Vitrified State Intra- and Extracellularly to Better Understand Cell Survival after Cryopreservation. Reprod. Med. 2020, 1(2):142-157.

[15]  Amir Arav, Yehudit Natan. The Near Future of Vitrification of Oocytes and Embryos: Looking into Past Experience and Planning into the Future. Transfus Med Hemother. 2019; 46(3): 182–187.

[16]  Rall, W.F.; Fahy, G.M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at 196℃ by vitrification. Nature. 1985; 313(6003):573-575.

[17]  Vanderzwalmen, P., Delval, A., Chatziparasidou, A., et al. Pregnancies after vitrification of human day 5 embryos. Hum. Reprod. 1997; 12:98.

[18]  P Mazur. Cryobiology: the freezing of biological systems. Science. 1970; 168(3934):939-949.

[19]  David Pegg, Fritz Kleinhans. In memoriam Peter Mazur – Cryobiologist. Cryobiology. 2016; 72: 83–85.

[20]  Schnebly, Risa Aria, "“A Two-Factor Hypothesis of Freezing Injury: Evidence from Chinese Hamster Tissue-Culture Cells” (1972), by Peter Mazur, Stanley Leibo, and Ernest Chu". Embryo Project Encyclopedia ( 2021-03-02 ). ISSN 1940-5030.

[21]  S M Willadsen, C Polge, L E Rowson, R M Moor.. Deep freezing of sheep embryos. J Reprod Fertil. 1976; 46(1):151-4.

[22]  Kilbride P, Lamb S, Gibbons S, Bundy J, Erro E, Selden C, et al. Cryopreservation and re-culture of a 2.3 litre biomass for use in a bioartificial liver device. PloS one. 2017; 12(8):e0183385.

[23]  Peter Kilbride, Julie Meneghel, Fernanda Fonseca, John Morris. The transfer temperature from slow cooling to cryogenic storage is critical for optimal recovery of cryopreserved mammalian cells. PLoS One. 2021; 16(11):e0259571.

[24]  Julie Meneghe,Peter Kilbride ,John G. Morris,Fernanda Fonseca. Physical events occurring during the cryopreservation of immortalized human T cells. PLoS One. 2019; 14(5):e0217304.

[25]  Jason P Acker, Locksley E McGann. Protective effect of intracellular ice during freezing? Cryobiology. 2003; 46(2):197-202.

[26]  Ming-Han Yu, Leah A. Marquez-Curtis, Janet A.W. Elliott. Cryopreservation-induced delayed injury and cell-type-specific responses during the cryopreservation of endothelial cell monolayers. Cryobiology. 2024; 115:104857.

[27]  Baust JM, Vogel MJ, Van Buskirk R, Baust JG. A molecular basis of cryopreservation failure and its modulation to improve cell survival. Cell Transplant. 2001; 10:561–571.

[28]  Isobel Massie, Clare Selden, Humphrey Hodgson, et al. Storage Temperatures for Cold-Chain Delivery in Cell Therapy: A Study of Alginate-Encapsulated Liver Cell Spheroids Stored at -80℃ or -170℃ for Up to 1 Year. Tissue Eng Part C Methods. 2013; 19(3): 189–195.

[29]  Benjamin P Best. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Res. 2015; 18(5):422–436.

[30]  Damien Laage, Thomas Elsaesser, James T Hynes. Water dynamics in the hydration shells of biomolecules. Chem. Rev. 2017; 117:10694–10725.

[31]  Xiaoqi Lang, Lixue Shi, Zhilun Zhao, et al. Probing the structure of water in individual living cells. Nat. Commun., 2024; 15, 5271.

[32]  孙怡然, 于飞, 马杰. 纳米受限水的研究进展.物理化学学报. 2017; 33(11): 2173-2183.

[33]  Marie-Claire Bellissent-Funel, Ali Hassanali, Martina Havenith, et al. Water determines the structure and dynamics of proteins. Chem. Rev. 2016;116:7673–7697.

[34]  叶树集, 李传召, 张佳慧, 等. 生物分子结合水的结构与动力学研究进展.物理学报. 2019; 68(1): 013101.

[35]  J Pedro de Souza, Howard A Stone. Protein condensation regulates water availability in cells. Nature. 2023; 623(7988):698-699.

[36]  杨帆,于鹏云, 赵娟, 赵岩, 王建平. 乙二醇的分子间氢键结构动力学的飞秒非线性红外光谱.物理化学学报. 2015; 31(7), 1275-1282.

[37]  Kirchner B, Reiher M. The secret of dimethyl sulfoxide-water mixtures. A quantum chemical study of DMSO-water clusters. J Am Chem Soc 2002; 124:6206–6215.

[38]  刘波，黄世萍，朱吉钦，王 鹏，田辉平. 温度对二甲基亚砜水溶液的结构和热力学性质的影响.物理化学学报. 2011; 27(2):289-294.

[39]  Lee E, Baiz CR. How cryoprotectants work: hydrogen-bonding in low-temperature vitrified solutions. Chem Sci. 2022; 13(34): 9980-9984.

[40]  Gregory M Fahy, Brian Wowk, Jun Wu, Sharon Paynter. Improved vitrification solutions based on the predictability of vitrification solution toxicity. Cryobiology,2004; 48(1):22-35.

[41]  Wallerstein J, Akke M. Minute Additions of DMSO Affect Protein Dynamics Measurements by NMR Relaxation Experiments through Significant Changes in Solvent Viscosity. Chemphyschem. 2018; 20(2):326-332.

[42]  Smondyrev, A. M., and M. L. Berkowitz. Molecular dynamics simulation of DPPC bilayer in DMSO. Biophys. J. 1999; 76:2472–2478.

[43]  Schrader AM, Cheng CY, Israelachvili JN, Han S. Communication: Contrasting effects of glycerol and DMSO on lipid membrane surface hydration dynamics and forces. J Chem Phys. 2016; 145(4):041101.

[44]  Zhi-Wu Yu, Peter J. Quinn. The modulation of membrane structure and stability by dimethyl sulphoxide (review). Review Mol Membr Biol. 1998; 15(2):59-68.

[45]  John G Baust, Dayong Gao, John M Baust. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 2009; 5(3): 90–96.

[46]  Best B.P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Res. 2015;18:422–436.

[47]  Fahy G.M., Lilley T.H., Linsdell H., et al. Cryoprotectant toxicity and cryoprotectant toxicity reduction: In search of molecular mechanisms. Cryobiology. 1990;27(3):247-68.

[48]  Giada Marcantonini, Desirée Bartolini, Linda Zatini, et al. Natural Cryoprotective and Cytoprotective Agents in Cryopreservation: A Focus on Melatonin. Molecules. 2022;27(10):3254.

[49]  Lin Ji, Juan J de Pablo, Sean P Palecek. Cryopreservation of adherent human embryonic stem cells. Biotechnol Bioeng. 2004; 88(3):299-312.

[50]  R Martin-Ibañez, C Unger, A Strömberg, et al. Novel cryopreservation method for dissociated human embryonic stem cells in the presence of a ROCK inhibitor. Hum Reprod. 2008; 23(12):2744-54.

[51]  Charles J. Hunt. Technical Considerations in the Freezing, Low-Temperature Storage and Thawing of Stem Cells for Cellular Therapies. Transfus Med Hemother. 2019; 46(3): 134–150.

[52]  Bissoyi A, Pramanik K. Role of the apoptosis pathway in cryopreservation-induced cell death in mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood. Biopreserv. Biobank. 2014; 12:246–254.

[53]  Sara Freitas-Ribeiro, Rui L Reis, Rogério P Pirraco. Long-term and short-term preservation strategies for tissue engineering and regenerative medicine products: state of the art and emerging trends. PNAS Nexus. 2022; 1(4): pgac212.

[54]  Young-Hoon Jeong, Ukjin Kim, Seul-Gi Lee, et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnol. 2020; 20: 45.

[55]  Parham Mashouf, Nahid Tabibzadeh, Shohei Kuraoka, et al. Cryopreservation of human kidney organoids. Cell Mol Life Sci. 2024 Dec; 81(1): 306.