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瀚海阑干百丈冰——冷冻保护剂在细胞低温保存技术中的应用
为了应对极地、高原等常年低温冰冻的环境，微生物、昆虫、鱼类和两栖动物等数十种物种，可长达数耐受询价度以下低温自然环境。如北极地区生活的地松鼠，体温为-3℃情况下冬眠3周后后，身体各器官不会被冻伤。
研究表明，多种耐冻物种的防冻关键策略之一是体内合成大量低分子量碳水化合物，增肌胞内粘性，同时稳定胞膜的磷脂双层，并限制胞内冰晶形成。或这合成或防冻蛋白，结合于冰晶表面，防止更多水分子在聚集到冰晶表面聚集，阻断冰晶成长 [1-2] 。
冰冻与解冻过程中，因为大量冰晶产生引发机械损伤和氧化应激效应，破坏细胞内外结构与功能，是导致细胞活力丧失的主要原因 [3] 。人们根据仿生学原理，在细胞低温保存液中添加各种冷冻保护剂，可将生物材料（如细胞、组织、器官）冷却至（−80℃至−196℃）低温，以抑制甚至完全阻断所有化学与生物反应。在必要时解冻复温后，生物样品仍保持功能完整性和正常结构。这种低温冷冻保存生物样本的方法，已在组织工程、遗传发育、生物医学应用和种质资源保存等多种领域得到了广泛应用 [2] 。
一、低温保护剂抑制细胞内冰晶的基本化学原理
在组织细胞材料低温保存时，通常会添加水溶性冷冻保护剂(Cryoprotectant or Cryoprotective agents, CPA)。CPA冷冻保存过程所发挥保护作用的机制目前并未完全清晰，一般认为可能与包括氢键调节、细胞膜特性改变及增加溶液粘度等多重因素间协同作用有关 [4] 。根据CPA穿透细胞膜能力的不同，大致分为细胞穿透型CPA、非细胞穿透型CPA两种类型，二者在细胞保存液中具有不同理化性能和功能。
1.1 细胞穿透型CPA的水合效应及防冻原理
细胞穿透型CPA，如甘油（glycerol, GC）和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、乙二醇（ethylene glycol, EG）、1,2-丙二醇（propylene glycol, PG）等，分子量低。细胞用含CPA渗透平衡溶液处理时，自由水通过胞膜扩散渗出胞外，CPA则经胞膜蛋白水通道进入胞内，补充了胞内溶质含量，实现胞内外环境的渗透压平衡，可避免细胞发生过度脱水。部分游离水将被CPA取代后，细胞内的溶液粘度增加，自由水分子扩散和聚集活动迟滞 [2] 。进入胞内CPA分子与水分子通过氢键发生水合作用。，如DMSO的亚砜基（S=O）与水分子形成氢键的强更高（约30 KJ/M），而水分子间形成的氢键强度低（约20 KJ/M)，故DMSO与水间氢键寿命是水分子间氢键寿命的数倍 [5] 。CPA与水分子牢固结合，胞内可用的游离水分子进一步减少。CPA与水分子形成的氢键使很大一部分水分子被“锁定”到无序构型中，限制大量的水分子间通过氢键生成四面体结构 [6] 。生成Ih构象冰晶所需的水分子聚合物无法大量供给，故抑制了晶核的形成和生长 [7] 。
正常情况下，细胞质中密布蛋白质、氨基酸、多糖聚合物、核酸等大分子及光面内质网、线粒体等细胞器与细胞骨架结构。又因自由水流失和CPA补充而变粘稠。当样本温度降低至过冷状态后，胞外溶液会首先形成冰晶。冰晶增长过程中，溶液中体相水体减少而出现溶液被浓缩和渗透压升高。胞外渗透压胁迫，诱使胞内自由水再次外流，细胞因此再次发生脱水过程，胞体收缩。经2次脱水后，胞质被极大浓缩，大分子相互聚集，呈现“大分子拥挤”（macromolecular crowding）和细胞器堆积现象。胞质由混悬液转变成粘稠胶体。当溶液温度快速降至玻璃化转变温度(glass‐transition temperature, Tg)以下时，粘稠胶体发生玻璃化转变，胞内体系呈现玻璃化固体网络，水、离子、DMSO、代谢物等被分割限制在大量网状孔隙结构中 [8] 。这些新形成的纳米尺度胞内孔隙造成自由水体积纳米化，外加体系粘稠度极大，水扩散积聚停滞，正四面体结构分子簇生成停顿，无法生成达到临界晶核尺度，从而彻底阻断了细胞内部的冰晶成核过程。
1.2 非细胞穿透型CPA的防冻保护机制
常用的非渗透性CPA，有小分子化合物蔗糖、海藻糖（非还原性双糖）和高分子聚合物聚Ficoll（即聚蔗糖，由蔗糖和氯甲基环氧乙烷共聚合生成，富含羟基基团，水溶性好，生物相容性优良，常用作细胞器、细菌分离提取的密度梯度离心介质）、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl pyrrolidone, PVP)等。这类CPA，无法穿透细胞膜，对抑制胞内冰晶生成作用不如DMSO有效。细胞冷冻保存液中添加非渗透性CPA，主要作用在于：
1）增加细胞外溶液渗透压，诱导胞内水分渗出，与渗透性CPA协同，促进细胞更快脱水。
2）可作为增稠剂，有助于溶液胶体化和玻璃化转变，提高体系玻璃化转变温度，降低临界降温速率(critical cooling rate, CCR)，更外实现样品体系的玻璃化转变。还可降低临界升温速率(Critical warming rates, CWR)门槛，确保现有复温技术条件下快速完成复温进程，抑制溶液冰晶再结晶。
3）细胞膜稳定作用：在复苏去除CPA过程中，因外部溶液低渗，水跨膜流入胞内，以便将胞内渗透性CPA置换出胞外，浓缩的细胞内容物逐步恢复到初始等渗状态。在缺少非渗透性CPA保护情况下，多轮的梯度溶液置换CPA操作，会因为胞内外渗透压差增大，导致胞体膨胀，质膜结构完整性丧失，甚至造成细胞死亡。而溶液中添加的非渗透性CPA，可在细胞表面形成粘性外壳，维持胞膜稳定，防止胞体发生过度渗透性膨胀损害 [9] 。蔗糖用于精子和卵母细胞的冷冻保存早已被证实行之有效 [10] 。
1.3 防冻蛋白的防冻机理
某些极地鱼类、昆虫和植物体内可合成抗冻蛋白(Antifreeze proteins, AFP)。AFP能通过与冰晶核相互作用来抑制冰晶核形成和生长，从而降低了溶液的非平衡结冰温度。这种使冰点低于熔点的特性，称为热滞活性(thermal hysteresis activity, THA)。因此，抗冻蛋白也叫热滞蛋白或温度迟滞蛋白(Thermal Hys-teresis Proteins, THPs) [11] 。不同自然环境下形成的冰晶形态复杂，故进化产生AFP的来源、序列和结构的具有多样性与复杂性。关于各种AFP抗冻作用机理，学界存在“成核抑制”、“吸附-抑制”、“受体-配体”模型及“锚定水合机制”(anchored clathrate water, ACW)等多种假说 [12] 。
AFP能通过其表面的冰结合位点(Ice-binding site, IBS)与冰晶吸附结合，阻止冰晶通过小晶体融合和奥斯瓦尔德熟化过程（Ostwald ripening，是指发生在过饱和固溶体或液溶胶中较小颗粒逐渐溶解，而较大颗粒不断长大导致颗粒平均尺寸增大的现象）继续生长而保护生物免受冰冻伤害 [10] 。
因AFP属于异源蛋白，会引发免疫反应，加之生物合成成本问题，在动物组织细胞保存中使用极少，故不作过多讨论。
二、低温保护剂在细胞冷冻保存过程毒性的基本认识
不同组织细胞的组分构成相似，但因温度、CPA浓度、暴露时长、载体溶液类型等实验条件不同，对CPA的毒性反应有诸多差异。有学者指出，细胞膜破裂或受损、酶功能异常、细胞或胚胎发育受阻、精子活力下降、线粒体功能减弱，或DNA、蛋白质等大分子结构遭到破坏，可视作衡量CPA细胞毒性的指征 [13] 。
CPA毒性可以是某种CPA发生在特定使用条件下、特定的细胞或器官时所出现的特异性毒性反应。譬如DMSO，是心脏保存中首选的CPA，但被公认为具有广泛的细胞毒性。在30℃条件下，当DMSO浓度达到10%（v/v）（即1.41 M）时，大鼠心肌会出现不可逆的超微结构改变。7.5%-10% （v/v）浓度梯度的DMSO暴露，可显著降低外周血祖细胞的克隆形成能力。小鼠成纤维细胞在37℃条件下暴露于10% （v/v）浓度DMSO 1小时，观察到细胞膜出现波动但未发生肿胀；20%浓度引发细胞吸水膨胀；30%浓度则导致质膜起泡，表明细胞膜与细胞骨架发生解离。数据显示，大鼠耳蜗细胞暴露于0.5%-6%浓度的DMSO 24小时后，其凋亡率呈现剂量依赖性上升趋势。
CPA毒性还可以是用于CPA时才出现的非特异性毒性。以丙二醇（PG）为例，当作为常用的食品添加剂，不仅无明显全身毒性作用，甚至还曾被用作乙二醇（EG）中毒的解毒剂。但当作为CPA使用时，PG往往表现出毒性。有报道证实，PG浓度超过2.5 M时会降低细胞内pH值而损害小鼠受精卵的发育潜能。器官玻璃化技术概念的提出者、美国低温生物学家格雷戈里·M·法希（Gregory M. Fahy)指出，CPA是通过干扰水分子之间的氢键作用来阻止胞内冰晶形成的，因此，CPA的这种毒性效应属于非特异性毒性[14] 。研究发现，DMSO能以浓度依赖方式调控生物膜通透性。5%（v/v）的低浓度DMSO会降低细胞膜厚度而增加其渗透性。常规使用的10%（v/v）浓度下，DMSO会诱导膜的水孔形成。当DMSO浓度升高至40%（v/v）时，还会破坏磷脂双分子层结构，造成细胞损伤或降低发育潜能。
在玻璃化冷冻和解冻过程中，卵母细胞会面临冰晶形成、冷冻保护剂（CPA）毒性、水分子及CPA分子穿越质膜扩散以及温度波动等多重挑战，从而引发化学、机械、渗透和热应激损伤。随后可能出现形态改变、卵丘细胞物理/功能脱离、染色体异常、线粒体功能与分布改变以及氧化应激，这些因素都会限制卵母细胞在玻璃化冷冻后的存活率和发育能力。因此，某些被归因于CPA毒性的现象，实际上可能是渗透休克（osmotic shock）、氧化应激（oxidative stress）损伤、冷休克（Cold Shock）、冷冻损伤（Chilling Injury）或其他损伤因素与CPA非特异性毒性交织作用所导致的 [13] 。
三、细胞冷冻保存中低温保护剂应用的新动向
DMSO和甘油这两种常用的低分子量CPA，已被证实会导致细胞损伤、肝组织表观遗传改变、诱导胚胎干细胞分化和临床应用安全问题。此外，部分细胞类型（如人类胚胎干细胞hESCs）在使用DMSO和甘油保存后，需经多次淘洗才能从细胞中彻底清除，不仅耗时较长，且清洗步骤可能导致高达0%的细胞损失，回收率低。
为克服传统玻璃化冷冻技术中DMSO应用局限性，科研人员已提出多种降低细胞保护剂（CPA）毒性的方法。如，通过优化CPA的添加与去除操作来最大限度减少毒性，开发新型具有生物相容性、高转染效率及快速释放特性的细胞保护剂，以来替代或减少DMSO的用量，并解决多细胞系统和全器官冷冻等复杂样本保存的难题 [4] 。
3.1 中性氨基酸类CPA的开发应用
多种中性氨基酸或其衍生物，如β-丙氨酸、γ-氨基丁酸和ε-氨基己酸等，可与水分子形成氢键，破坏水分子间的连接并抑制冰晶形成，减轻冰晶对细胞造成的渗透和机械损伤。这类化合物显著提升了生物相容性与冷冻保护效果，同时将细胞毒性降至最低，有望实现无核及有核哺乳动物体细胞的高效冷冻保存 [15] 。
3.2 传统CPA运用方案的优化
CPA细胞毒性反应与温度、CPA浓度和渗透性和暴露时间有关。通常，高浓度、较高温度下CPA被认为毒性更强。浓度和温度越高，CPA渗透得越快，细胞质就会膨胀甚至膜破裂风险越高。在现有成熟技术基础上，通过CPA间组合应用，可降低单一种类CPA毒性。
(1) 渗透性CPA组合应用
一项CPA对猪关节软骨细胞毒性实验结果显示：37℃温度，相同终浓度（CPA 3M以内）和暴露时间（120min以内）条件下，PG毒性最强，DMSO和FMD毒性稍弱，EG和GLY毒性最低；所有双CPA组合的毒性均低于单一CPA。3M浓度的EG-DMSO-GLY溶液能维持细胞膜完整性。类似研究表明，DMSO与PG联合使用能有效降低两种CPA毒性，提升细胞存活率。近年来，将传统膜渗透型CPA组合成功运用于类器官保存开始见诸报道。
在肾脏类器官玻璃化保存技术研究中，脱水平衡液采用含谷氨酸的RPMI培养基，添加10% DMSO、10% 乙二醇的配制，玻璃化溶液则是含谷氨酸的RPMI培养基中添加20% DMSO，20%乙二醇和0.75M蔗糖制备。解冻后，肾脏类器官出正常生长，内部个功能结构和功能活力得以完好保持。这种方法还适用于肠道模型类器官的平衡-玻璃化-升温解冻处理。
操作基本步骤包括 [16]：
A- 用移液器提取四个类器官，转移至Eppendorf 管中；
B- Eppendorf 管中含有200μL用以谷氨酸RPMI 培养基添加10% DMSO、10% 乙二醇的配制的平衡溶液；
C- 将类器官在室温下浸入平衡溶液中为8-15分钟，以便CPA充分渗透到肾脏类器官中；
D- 将类器官转移到含有 200 μL玻璃化溶液的冻存管中；
E- 玻璃化溶液中DMSO、乙二醇的含量调整为20% DMSO、20% 乙二醇，类器官玻璃化液处理时间10秒；
F- 将冻存管直接暴露在液氮中 10 秒；
G- 将冷冻管转移至-150℃深低温冰箱中保存。
(2) 渗透与非渗透型CPA组合应用
海藻糖为可溶性、非还原性的葡萄糖二糖，能够通过取代水分的方式为胞内生物大分子提供保护性“水合”作用，有利于维持大分子活性结构。蔗糖和海藻糖等还可在细胞表面形成粘性外壳来保护细胞膜。将非渗透型高分子量聚合物CPA与渗透型CPA或玻璃化方案结合使用，防止在解冻后去除CPA过程中细胞发生过度的渗透性膨胀 [9] 。低浓度海藻糖和DMSO联合使用已成功冷冻保存小鼠卵母细胞 [17] 。玻璃化冷冻是临床上首选的卵母细胞和胚胎冷冻保存方法，还可用于大容量储存和全器官冷冻等缓慢冷冻不适用的场景。要实现玻璃化冷冻，需要使用高浓度的渗透性和非渗透性CPA，并配合快速冷却速率以避免冰晶形成。通过1.5 M丙二醇和0.5 M海藻糖对直径70µm的AML-12肝细胞液滴进行玻璃化冷冻，解冻后存活率可达~90%，实现了低浓度CPA条件下的冷冻保存 [4] 。聚乙烯醇（PVA）等冰重结晶抑制剂（ice recrystallization inhibitors,IRIs）是一种低分子量CPA，可进入细胞，影响细胞内冰重结晶的能力，减少冻融过程中的不可逆蛋白质聚集。
(3) 大分子两性聚合物与DMSO的组合
当前研究热点是开发新型合成与天然聚合物，包括部分不具备特定冰晶结合或抑制冰晶重结晶活性的聚合物，以替代或减少有机溶剂用量，又提高解冻后的细胞存活率。分子同时包含混合阳离子和阴离子侧链的聚合物，属于两性电解质，可调控冰晶重结晶抑制，降低脂质玻璃化转变温度（Tg）而发挥保护作用。尽管其活性强度与强效的IRI PVA相比活性较低，但在玻璃化冷冻和缓冻保存方案中表现优于IRI类材料。在冷冻保存时同时使用聚两性电解质和DMSO时，解冻后的存活率较高。表明，聚两性电解质与渗透性CPA（如DMSO）之间存在协同作用。
聚木甘露聚糖具有调控冰晶生长的作用，但其结构与性质的关系尚未明确。来自肠杆菌A47的富岩藻糖阴离子多糖FucoPol在浓度2.5mg/mL时即能使DMSO冷冻保存的细胞解冻后存活率提升70%。其确切作用机制尚不明确，且对冰晶生长影响甚微，推测可能通过降低过冷度发挥作用 [4] 。
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