零丁洋里叹零丁——从水的微观结构看低温冻存细胞内的冰晶生成

       水是生命之源，因为地球上所有生命过程都是在水环境中发生的。水是生物赖以生存的最有价值的物质资源。动物细胞质量的70-85%都是水，其中，胞质部分水含量占细胞水总质量的50-60%，细胞器中的水占比20-30%，细胞核中所含水份占比最低，为10-15%。20世纪70年代以来，随着电解质、蛋白质、核酸、多糖等生物大分子对水理化性质及结构状态的影响，水分子在生物大分子三维结构中的定位以及水分子对大分子构象与生物功能维持中的作用，细胞内部区室对对水分子的运动、扩散阻挡效应，水在膜结构中的定位和功能等重要问题研究的开展，为水与细胞酶激活、能量代谢、生长繁殖和膜功能活动等的关联提供了新的见解。

       水与细胞体系间相互作用的多样化，归根到底，与水的微观结构复杂性有关。特别是，当我们想探索和改进细胞低温冷冻保存技术方法的时候，液态水的微观结构的特殊性和对谁理化性质的影响，就不得不察。

一、水微观结构的基本概念

       2005年,《Science》杂志将水的结构列为人类所面临的125个难题之一。2016年，学者卡特琳·阿曼-温克尔（Katrin Amann-Winkel）在《Reviews of Modern Physics》撰写的“水的有争议的玻璃过渡”一文所说的那样：人们对水研究最多却依然知之甚少；研究投入精力越多、研究手段越先进，对水认知却越感迷茫。

       关于液态水微观结构的认识，很早就建立有分离模型(也称混合模型)和连续模型两种对立的理论 ^[1] 。但直到1960年，Pauling在《化学键的本质》中提出氢键的概念后，对液态水的微观结构研究才逐步走向深入。

       水分子由1个氧原子和2个氢原子通过极性共价键结合而成的。由于H、O原子间共用电子对强烈偏向O原子，导致水分子的极性特性，共价键内电子云分布不均衡：H原子带正电而O原子带负电。O原子会与相邻水分子中的H原子产生相互吸引作用形成“氢键”（hydrogen bonding） ^[2] 。氢键的键长与键角可因环境而变。氢键是水的微观结构中最重要的相互作用力之一,但氢键作用弱。常温下，水分子处于剧烈的热运动状态，并可自由旋转。因此，水分子间相对运动，使脆弱的氢键不断的运动和重组，整个氢键网络存在高度不稳定性和动态调整 ^[1] 。

       按分离模型理论, 水分子通过氢键形成含水分子数目不一的小水分子簇（water molecule clusters）。这些水分子簇见相互分离,不同簇有着不同的氢键结构。而液态水则是一系列包含多种构型水分子簇的混合物 [1] 。理论上，液态水中，一个水分子最多可与周围相邻的4个水分子通过氢键连接成一个正四面体晶体结构（如图1，1个核心水分子位于中心，4个顶点为4个水分子的O原子）。四面体的外围四个水分子构成围绕中心水分子的第一个水分子壳层。因水分子的位置不固定，四面体结构处于解体和重构的动态变换中。

       实际上，一个水分子与周围水分子形成的氢键结构是动态变化的。Saykally观察到每个水分子平均形成3.3个氢键现象，证实液态水的主要微观构型是四面体结构。Nilsson提出，单个水分子所形成的氢键数量、结构与水温有关。在25℃～90℃范围内, 大部分水分子结合最紧密的外围分子数不是四面体结构那样4个, 而是2-3个，其中两个是强氢键，一个是弱氢键。因此，液态水内部的微观结构并非只有单一正四面体结构一种，还存在“绳圈”构象模型(ring conformation)。这两种构型水分子簇可以相互转换，各自的组成比例受温度影响而波动。水温降低时，四面体构型的比例会升高 ^{[1, 3]} 。常温下，绳圈构型对水理化性质的影响比四面体构型更重要。在过冷水中，绳圈构型会转变为四面体构型 ^[4] 。因此，水温越低，水分子数量更多、氢键网络结构更复杂的水分子簇组成比例越高。

       即便是四面体结构，也可以细分出低密度（L）、高密度（H）和超高密度结构（U）至少三种不同亚型 ^[5] 。L构型的中心水分子与第一壳层水分子形成对称的四面体空间结构，距离相对较远的邻近水分子则处在第二水分子壳层上，两个壳层的间隙大，故分子质量密度较低；H构型的中心水分子与第一壳层水分子形成的结构中，氢键扭曲，四面体结构存在坍塌，造成第二壳层水分子进入到第一二壳层之间的间隙中，两个水分子壳层的间隙压缩，故分子质量密度升高。在液态水中，这L、H两种构型水分子簇的比例会因温度改变。温度升高时，H构型成分增加而L构型成分减少 ^[6] 。水的各种奇异性质，据说可能与这两种成份间的转化有关。U构型为超高密度（五氢键）水分子簇结构，水分子能与邻近的五个水分子形成氢键。U型水分子簇并并凝聚在一起，而是分散在H构型水分子簇群中。在常温常压下，U型水分子簇的组成比例约占7%，随温度上升则占比增加。

       水的微观结构涉及水分子氢键的形成、水分子排列及不同状态下的动态变构，会对水理化性质有重要影响。水环境的温度变化、盐度改变、PH值波动等条件不同，可能导致水分子簇的构型、氢键数量存在差异。而不同类型水分子簇与细胞内生物大分子、极性分子、带电粒子的水合物的结构与稳定性因此而存在差别，包绕在生物大分子和荷电粒子表面的水分子壳层厚薄不同，使得细胞内自由水的重新分布，可能会对细胞内外生理环境产生影响。

       与分离模型相对，在连续模型中，所有水分子都被纳入一个统一的氢键网格，其能量和几何参数是连续分布的。水分子形成的准晶格会因热、静电和其他作用而变形，而氢键也因此经受拉力和弯曲，造成氢键网络结构变化。这种不稳定的氢键网络，使水的微观结构具有高度随机性和复杂性 ^[3,7] 。当有新的物质溶入水中，将不同程度地改变氢键网络。譬如，添加盐会让氢键更紧密，而乙醇溶入会让氢键网络变松散。

       水分子中氢键网络由于处于不断地断裂与重构的动态过程中，使得水中的氢键并不仅仅局限于水分子之间产生，水分子还可与蛋白质、氨基酸、多糖聚合物、核酸等生物大分子以及乙二醇（ethylene glycol, EG）、二甲基亚砜（(Dimethyl sulfoxide, DMSO)等许多水溶性化合物分子间发生氢键。而这正是我们要从液态水的微观结构出发来重新认识和审视组织细胞低温冷冻保存技术的原理与方法的原因。

二、从水分子到细胞内冰晶的形成历程

       氢键作用强度比共价键弱，与水分子之间的有序排列与无序热运动之间存在竞争关系。水温高于4℃时，水分子热运动较剧烈。受水分子间无序碰撞影响，氢键生成后会迅速断裂，难以产生大量结构稳定的缔合水分子簇。当水温低至0℃以下时，水分子热运动动能降低，氢键的键合作用超过了水分子热运动冲击效果，则越来越多的水分子通过氢键结合并形成分子规则排列的四面体结构。温度越低，水分子间越容易形成四面体。游离的水分子所形成各种不同空间构象水分子簇的组成比例与结构转换，导致液态水的水的粘度、焓和表面张力改变，进而又影响水过冷和冰晶形成。

       冰作为水的一种凝聚态形式，有超过20种不同的晶相和非晶结构形式。其中有19种为晶体结构，但只有六方相冰Ih和立方相冰Ic可在自然界中自发形成和存在。其中冰Ih在自然界中最为常见,如冬日的雪花、南极冰川等固体冰，都是Ih晶体相。而Ic结构冰晶只存在于很低温度环境下。Ih中的罗马字母I代表它们是人类所发现的第一个晶体相, 字母h代表其六角形(Hexagonal)规则排列的结构。Ih中的氧原子规则地排列在六角形晶格上，Ih内每个水分子可与最近邻的水分子形成4个氢键, 并且每个氧原子与4个相邻氧原子形成一个四面体空间构型 ^[8] 。

       目前认为，冷冻保存复苏过程中，细胞内大量冰晶的形成以及由此所导致细胞结构与功能的损伤，是复苏后细胞死亡的重要原因 ^[9] 。

       溶液结晶是一种结晶性材料制备方法，其过程始于三维晶核的形成，即成核。随后通过晶核线簇的多面化以及二维晶面介导的生长过程，晶核方可形成宏观可见的晶体。但目前关于晶体的成核机理仍然不清晰。最早的晶体成核理论为经典成核理论(classical nucleation theory)。该理论认为晶体的成核与生长过程是通过原子、离子或分子等单体在逐步附着和脱附动态平衡中实现的，同时伴随着密度和结构的变动。溶液线簇的堆积结构有序、线性而均匀。而越来越多的研究表明，许多晶体在成核前会产生尺寸小于60 nm的溶液前聚体，通常以无序团簇、聚集体团簇、纳米粒子、低聚物等形式存在，这些结构往往是无序的、非线性的、不均匀的。经典成核理论中的溶液线簇结构及其行为的描述方法在含有溶液前聚体的物系中并不适用。为了解决这一问题，二步成核理论(two-step nucleation theory)、预成核团簇理论(pre-nucleation clusters theory)、粒子附着晶化理论(crystallization by particle attachment theory)等具有代表性的非经典成核理论相继被提出，仍有待完善。

       无论是经典或非经典晶体成核理论，水溶液结冰过程，始发逾水分子单体相互碰撞后生成水分子簇，小水分子簇之间进一步聚集后形成晶核。晶核在有足够的游离水分子存在和适度温度条件下，体积增长达到临界体积后转变成临界晶核。而大量水分子按Ih冰晶体结构要求有序结合到晶核上，晶核成长为宏观尺寸的晶体 ^[10] ，液体才会开始冻结。反之，任何尺寸小于临界成核尺寸的晶核，将自发缩小消亡而不会形成冰晶。

       水温度低于0℃冰点后，不会立即发生液固态转变，而是处于“过冷”(supercool)的状态。溶液过冷度用于描述溶液温度与平衡熔化温度（equilibrium melting temperature, Tm）值的偏差程度。温度越低，偏离Tm值越多，则溶液过冷度越高，成核临界尺寸越小，液体自发形成的晶核概率越大。可见，水溶液结冰凝固一是要温低于过冷度临界温度，二是晶核大小达到成核临界尺度。一般认为，溶液结晶的起始温度介于Tm和均相成核温度（homogeneous nucleation temperature, Th）之间。

       过冷状态的水分子呈现三种形态，即自由水分子，缔合水分子和四面体晶体结构。在晶核未达到临界尺寸前，这种趋势就会持续存在。但一旦条件有利，就会聚集成更大的晶核并在溶液中高速传播。当温度低于Th时，均相水溶液最终会自发均匀成核而凝固 ^[11] 。纯水匀相成核温度，一般认为是-41℃（272K）。

       计算模型显示，生成稳定晶核的机率与样品体积相关。溶液体积越大，自由水越多，越有利于晶核成长 ^[12] 。反之，限制自由水分子的体积和水分子的扩散与聚集，将造成晶核发育过程受损，可有效阻遏液体冰晶的形成。

参考文献

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[10]  汪帆,刘岩博,李康丽，等.溶液结晶中的介尺度成核过程研究进展.化工学报,2022,(6):2318-2333.

[11]  Pierre Vanderzwalmen, Fabien Ectors, Yannis Panagiotidis, et al. The Evolution of the Cryopreservation Techniques in Reproductive Medicine —— Exploring the Character of the Vitrified State Intra- and Extracellularly to Better Understand Cell Survival after Cryopreservation. Reprod. Med. 2020, 1(2), 142-157.

[12]  Karlsson JO, Cravalho EG, Borel Rinkes IH, et al. Nucleation and growth of ice crystals inside cultured hepatocytes during freezing in the presence of dimethyl sulfoxide. Biophys J. 1993 Dec;65(6):2524–36.