瀚海阑干百丈冰——生物样品玻璃化低温保存技术的应用原理及实施方法

       早在公元前2000多年前，两河流域的古人发明了玻璃生产技术。美国金属学会（ASM）将此评为人类历史上“10个最伟大材料事件”之一。玻璃是人类使用历史最长、最广泛的非晶态物质，因此，非晶态材料又称为玻璃态材料。然而，材料的玻璃态本质是什么，很长时间来科学界并无定论。2005年，《Science》将其列入21世纪重大科学问题 ^[1] 。

1、生物样本玻璃化保存技术的概念

       玻璃态物质内部具有与液体分子无序排列相似的特点，但分子不能自由运动。材料内部粘滞系数极大，无流动性，具有晶态固体般的硬度，是不同于晶体、液体的“非晶态固体”。材料玻璃态转变，反映的是材料分子链局部的微布朗运动形式转变，有材料特异性和温度依赖性。当温度降低至特定温度以下，材料分子的整体运动处于“冻结”状态，只有分子链上的原子或基团可以在其平衡位置振动，材料整体表现为刚性固体状，类似于玻璃。反之，当温度上升至特定温度以上，分子链整体运动虽依旧冻结，但分子侧基、支链等开始出现转动、移动和摇摆运动等变化，材料整体表现出高弹性，称为高弹态或橡胶态。非晶态材料在玻璃态、高弹态间的转变，称为玻璃态转变(glass transition)。转变发生的温度，称为玻璃化转变温度(glass transition temperature, Tg)。Tg为一区间值，有Tg起点、终点和中点之分，习惯上可用中点温度指代特定体系的Tg值。

       通常，转变前后材料的多种多物理性质，如体积，膨胀系数、比热容、导热系数、介电常数等会发生剧变。当材料温度低于Tg时，粘度极高（η＞1014 Pa•s），内部分子运动阻力极大，分子扩散速趋于停止，各种化学反应速率极低。体系内自由体积、内能和熵等热力学属性保持稳定。故玻璃态体系具有高物理和化学稳定性 ^[2] 。而温度高于Tg时，材料开始向高弹态转变, 分子链段的运动解冻，体系粘度骤降，分子扩散系数上升，各种反应速率加快, 体系内部理化稳定性降低。

       基于这一原理，食品经玻璃化技术处理后，食品的质构、纹理、微生物活动、酶活化等引起食品变质的理化反应极其缓慢，有利于食品贮藏保鲜。而制药生产中，采用玻璃化技术优化配方，可延长药物保质期 ^[3] 。

       生物医学领域，样品材料低温保存的玻璃化技术应用，同样引发了科学界高度关注和大量探索实践。

2、玻璃化生物样本保存技术的重要价值

       在低温保存过程中细胞内外冰晶形成与生长，会导致机械损伤和氧化应激效应，破坏细胞内外结构与功能，如微管断裂、DNA片段化、RNA降解及核蛋白复合体结构改变 ^[4] 。冰晶所导致细胞损伤，是冷冻保存期间细胞死亡的重要原因 ^[5] 。许多研究报道了冷冻保存诱导的分子细胞死亡相关的激活途径，包括肾细胞、成纤维细胞、肝细胞、外周血单核细胞、脐带血、精子、卵母细胞、卵巢组织、血管组织等，涉及细胞膜、细胞核和线粒体等起始损伤位点 ^[6] 。鉴于所检测到的各种细胞的坏死和凋亡，通常是在复温后的24小时内逐渐显现，故把这种细胞死亡现象称为冷冻保存诱导的迟发细胞死亡（cryopreservation-induced delayed-onset cell death, CIDOCD），造成细胞复苏后活力和恢复率降低 ^[7] 。

       冻伤双因素假说（A Two-Factor Hypothesis of Freezing Injury）创立者之一、美国冷冻生物学家彼得•马祖尔(Peter Mazur)。发现，当冰晶体积达到卵母细胞内部空间的16%就会导致细胞死亡。要防止细胞死亡，应完全避免细胞内结晶。将细胞保存溶液玻璃化处理，是避免冰晶生长的理想解决办法 ^[8] 。

       生物样本低温保存中的玻璃化（vitrification）技术理念，由瑞士科学家巴希尔•J•吕耶特（Basile J. Luyet）于1937年的论文“The vitrification of organic colloids and of protoplasm”最早提出。其原理是通过超快速冷冻方法将液体直接转化为胶体非晶态固体，避免保存液中冰晶生成。1985年，美国科学家首次将这一理念应用于小鼠胚胎的冷冻保存取得成功。此后，玻璃化技术开始大量用于哺乳动物胚胎的低温保存研究应用。1997年，玻璃化保存的人体胚胎与辅助生殖技术（assisted reproduction technology, ART）结合妊娠获得成功 ^[9] ，推动了玻璃化冷冻技术的应用的深入，提升临床妊娠成功率，提高了不孕不育人群的幸福感。

       细胞保存溶液转化为非晶态玻璃后，水分子运动受限，冰晶生长受阻，降低了冰晶致损风险，活细胞结构完整性和功能活性均得到有效维持 ^[10] ，因此，在哺乳动物胚胎组织和器官长期保存中有巨大应用潜力 ^[xx] 。

概括起来，组织细胞样品玻璃化的积极意义主要有以下三方面。

1）阻遏胞内冰晶的生成

       胞内完成玻璃化转变后，细胞器与生物大分子组成的固态网状物，将胞内空间分割出分散、互不连通的孔穴。孔穴平均孔径通常不到 10 nm，内部与残留的液体（含有水、离子物质及代谢物等小分子物质） ^[2] 。这些纳米尺度的孔穴内，已有相当比例的水分子与冷冻保护剂分子发生键合，残余水分子无法自由扩散和大规模积聚，晶胚发育受损，有效阻抑胞内冰晶的大量生成 ^[11] 。

2）阻抑生物分子的扩散

       胞内胶体玻璃的粘度可高达100 mPa.s ^[2] ，而温度极低，水分子热运动动能极低，各种活性大分子、物质的扩散、主动转运停滞，细胞新陈代谢活动有关的基本化学和生物反应陷入停顿 ^[12] 。

3）结构维稳与活力保鲜

       胶体玻璃化体系的物理化学保持高度稳定，细胞内外物质交换的停止，细胞各生物组分的组成与细胞质膜结构得以固化，有效地保存了细胞功能活力和恢复能力，可使组织细胞“青春永驻”。

3、生物样本玻璃化保存的技术要求和实施方法

       几乎所有的物质在一定条件下都可以转换为玻璃态。常见的非晶态材料制备方法是熔体急冷法。以玻璃生产为例，先将玻璃制作原料加热熔融成液体后，快速冷却至特定Tg，即获得固化的非晶态玻璃。同样地，将过冷细胞保存液以极快速度降温至溶液Tg以下，可跨越结晶过程直接转化为玻璃态。这期间，不仅要有效控制细胞脱水程度，还需实现溶液极速冷却，在最短时间内实现样品温度从平衡熔化温度（equilibrium melting temperature, Tm）和均相成核温度（homogeneous nucleation temperature, Th）直降到玻璃化转变温度（Tg）以下。

       一般而言，组成固定的材料，Tm、Th和Tg是恒定的。譬如，纯水Tg为-137℃。但对于细胞保存溶液，通常含有盐、氨基酸、蛋白质和低温保护剂，组分繁杂而不统一，Tm、Th和Tg会随细胞类型、溶液组分构成不同而变化。其中，细胞的蛋白质含量以及冷却过程的脱水程度决定着样本溶液的Tg。样本的蛋白质浓度和脱水程度较高，则Tg较高。相对于纯水，细胞低温培养基Tg值-123℃显著高于纯水Tg ^[11] 。用含10% DMSO的CryoStor10保护溶液制备0-50%（W/W）浓度梯度的牛血清白蛋白缓冲液，在以2℃/min降温速率冷却至-150℃过程中，差示扫描量热（DSC）检测结果显示，随着牛血清白蛋白浓度从0%-10%-20%-30%-40%-50%渐次递增，混合溶液Tg（中点值）从-72.9℃一路飙升至-22.9℃ ^[2] 。

       不同类型的组织细胞，蛋白含、核酸和脂质等含量不同，玻璃化转化实施条件会必然存在差异。与哺乳动物细胞相比，细菌胞内具有更高蛋白质含量，故菌体Tg值高于动物细胞。不同物种（譬如人类和马）精子冷冻保存中胞内玻璃化转变Tg也存差异。由于卵母细胞膜脂肪酸组成中的多不饱和脂肪酸较少，卵母细胞胞膜对冷冻敏感性高，与胚胎相比，卵母细胞比胚胎冷冻保存难度更大 ^[13] 。此外，冷冻保护剂浓度高，对应样品的Tg值相对较高。精子具有非常致密细胞质，游离水含量少，精子玻璃化过程可大幅降低CPA运用浓度。这与适用于卵母细胞和胚胎的方案中队较高浓度CPA的依赖有根本区别 ^[2] 。

       在细胞保存溶液体系中，胞质因溶质浓缩、细胞器与生物大分子堆积，密度增大，粘度升高，呈胶体状态。故细胞的Tg通常高于胞外溶液的Tg。在降温过程中，胞内要先于胞外溶液完成玻璃化转变。含DMSO（4.5% w/v）的乳酸杆菌样品的DSC测试显示，细胞内Tg为-51℃，而胞外溶液Tg为-120℃ ^[11] 。由于细胞内与细胞外溶液的Tg的悬殊差异，当胞内已实现玻璃化化时，胞外溶液尚未达到Tg。胞内纳米孔隙内与胞外的溶液中，小分子溶质还保持一定程度的流动性，在胞外区室和细胞膜之间依然存在生物活性反应。只有体系整体温度低于胞外溶液Tg时，局部的这类小分子活动才会完全停止。因此，要确保体系长期稳定储存，最终保存温度必须低于细胞外介质Tg。含冷冻保护剂DMSO的胞外保存液Tg通常介于-120℃ ～ -123℃区间 ^[14] 。

       关于细胞样品玻璃化处理所需的理论临界冷却速率（critical cooling rate, CCR)有107℃/min ^[15] 、106℃/min ^[6] 、100000℃/min ^[11]以及450000℃/min ^[13]等多种理论模型推导值。实际工作中，由于低温保护剂的运用、不同细胞类型的表面积与体积比以及细胞过程中水分流失量的差别，玻璃化转变的实际CCR值远低于上述理论值。据报道，在运用高浓度低温保护剂前提下，实现玻璃化的CCR为10–1000℃/min ^[5] 。冰核形成温度为-12℃，酵母菌溶液玻璃化的CCR为10～100℃/min，而人类红细胞的CCR为1000～5000℃/min，二者相差达50～100倍之多 ^[16] 。

常见程控降温仪产品降温性能参数对照表

       就目前实验设备控温性能，无论是Thermo CryoMed TSCM17SV、贝纳吉CX17等液氮蒸气制冷型程控降温仪，还是Grant CRFT、STREX CytoSAVER等氦气斯特林压缩机制冷系统，最高制冷速率与样品快速降温要求难以匹配。相对而言，液氮蒸气型降温仪的降温速率更接近玻璃化CCR要求。考虑到液氮温度低于液氮蒸气，且液氮的热力学传导效率高于液氮蒸气，故采用液氮降温，就成为现实条件下更经济、简便和可行的快速降温手段。

       另外，通过合理运用冷冻保护剂，既降低样品体系的Tm、Tg，又升高了Tg，极大缩窄样品Tm-Th-Tg温区跨度，通过将组织细胞样品直接浸入液氮(−196℃)实现样品玻璃化更具可行性和经济性。液氮玻璃化降温法操作流程，简单说来，是先将细胞或组织进行3-5个浓度梯度的冷冻保护剂预平衡，在将样品容器直接浸入液氮进行短时快速降温后，即可转入Thermo CryoExtra 40、贝纳吉YDD-460-320P这类高效液氮气相储存罐或-150℃深低温冰箱中长期保存 ^[17] 。

4、生物样本玻璃化保存技术所面临的挑战

       伦敦大学学院进化生物化学教授、2016年皇家学会迈克尔•法拉第奖获得者尼克•莱恩(Nick Lane)指出，冷冻保存技术堪称科学界最棘手的难题之一。马祖尔也指出，单纯基于生物物理学原理建立的方法无法从根本上解决现存冷冻保存的技术难题。

       尽管科研界层投入大量精力研究细胞冷冻保存技术，但迄今为止，并非所有哺乳动物细胞都能实现“同等”有效地保存。直接沿用传统细胞冷冻储存方法进行未完全分化的天然或工程化哺乳动物细胞的保存时，往往难有成效。即便是“成功保存”的细胞系，虽细胞外形和结构并无异常征象，但在解冻后24-48小时内常出现30%-70%的死亡率 ^[6] 。

       细胞复苏后延迟性死亡的原因有多种，譬如：玻璃化细胞解冻复温过程高浓度冷冻保护剂暴露期间的细胞毒性，临界升温速率（Critical warming rate, CWR）过低所致结冰、再结晶和样品开裂造成的细胞损坏等。无论是高浓度冷冻保护剂毒性侵害、冰晶再生成或玻璃化体系内部开裂，固然可通过提高解冻复温速度缩短危害暴露时间来解决。但复苏期过程规避细胞受损风险所需CWR通常比实现玻璃化状态所需的CCR高一到两个数量级。以酵母为例，40000℃/min的 CWR方案，复苏后存活细胞数量要比1℃/min CWR方案获得的活细胞数高出7个数量级。如此高的CWR，绝非依托普通37℃恒温水浴所能实现 ^[4] 。对于大多数细胞实验室而言，高CWR技术路线落地施行难度不小。

       在一个保存周期内，细胞通常须两次穿越-15℃～-60℃的中间温度区间：一次是冷却阶段，另一次是解冻阶段。体系温度高于Tg，胞外溶液有冰晶存在时，胞质可能因胞外冰晶穿透质膜而诱发异相成核，故细胞的冰晶成核典型温度覆盖范围极为宽泛（从-5℃～-30℃甚至更低温度），胞内冰晶暴露风险高、时间窗口长 ^[6] 。造成了常见的样品解冻去玻璃化过程中的冰晶成核及重结晶现象 ^[12] 。此外，脱水细胞在解冻过程中长时间若暴露于胞外低渗缓冲液中，水分通过细胞膜大量涌入，引发细胞变形甚至裂解。

       除了CWR，玻璃化样品复温成功的另一个要素，是样品体系内部的均匀升温。样品内部升温不均衡，则出现温度、导热系数、膨胀系数差异化区带，区带间的组织应力往往引发固化样品裂纹或断裂。因此，对于玻璃化的大型生物样本、组织和器官复温过程，有效的CWR方案以避免断裂产生仍是一项严峻的挑战 ^[18] 。

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