试析NanoDrop OneC微量紫外可见光度计常规维护的必要性及要点

       赛默飞公司旗下NanoDrop One（NanoDrop One Micro volume UV-Vis Spectrophotometer）、NanoDrop OneC为代表的微量紫外可见光度计产品在分子生物学实验中应用的大获成功，最重要的原因就是应时而生：只需区区2μL而非20μL、50μL、100μL、500μL甚至750μL样品，就完成了核酸的纯度（A260/A280、A260/A230）和浓度（A260）的测定工作，首先从样品体积上实现了affordable。其次，测试中无须消耗一次性紫外透射型比色皿，无须进行装样-测定-清洗比色皿-再重新上样的重复操作。只需低廉、干净的拭纸一角轻轻擦拭两下，就可进行下一个样品的测定，时间和经济帐上更是affordable。
       在各种渠道和形式的宣传中，NanoDrop系列微量紫外可见光度计俨然成了终身免校正、免维护的“国民紫外”。而对实验者和仪器管理人员，来之即用，用后关机，维护全免，正好落个清闲！
       那事实果真如此吗？
       NanoDrop One、NanoDrop OneC的共同工作部件有触摸屏、检测臂和样品基座。此外，NanoDrop OneC配置有比色皿检测模块，用于完成动力学测试、OD600细胞/菌体浓度测定、GMP等规范所要求的稀释样品检测等由常规紫外可见分光光度计担负的工作。撇开触摸屏、比色皿模块这两部分，NanoDrop仪器常规样品测试中，到底有哪些不可或缺的维护规程？

一、检测基座工作面的清洁（Cleaning the Pedestals）
       检测基座工作面包括上基座（upper pedestal，可升降的检测机械臂接触样品的部分）和下基座（lower pedestal，底座上承接液样的突起柱头）。上下基座外围为白色303不锈钢材质，正中为可透射紫外的石英光学玻璃窗。

       光学窗口残留的液体、普通擦拭用的纸巾纤维以及实验室尘埃颗粒、化学染料附着，都直接干扰吸光度测定值。故基座的仔细清洁是必不可少的操作环节。
       基座清理分为测试样品间隔的清洁、不同实验样品测定后的清洁和测定中发生样品污染的清理。
1.1 两个样品测试间隔的基座清洁
       由于NanoDrop系列仪器都是利用液体表面张力作用形成的微细液柱来测试，光路要从上基座穿透液柱进入下基座后进行检测器。因此，清洁时应抬起仪器检测臂，上、下基座全擦遍，而非只把下基座圆柱头一擦了事。忽略擦拭上基座或擦拭不细致，残留细微液珠势必造成样品交叉污染，失去精确测定的意义。

 
       清洁应使用适合于洁净间、精密光学实验设备用的专业无绒低尘擦拭纸（譬如金佰利公司Kimwipes小绿盒低尘擦拭纸等），而非日常生活普通清洁纸巾。 

1.2不同用户上机前后的基座清洁
       建议每个新用户在第一次空白对照样品检测或样品检测前和每批样品检测结束后，使用去离子水(deionized water，DI H2O)或实验室二级纯水（RO反渗透水）、实验室无尘纸，对样品基座进行彻底清理。

       规范操作手法是：
1）抬起检测臂，用新的实验室无尘纸擦拭上下基座；
2）用移液器吸取将 3–5μL去离子水添加至下基座；
3）降下检测臂保持2分钟；
4）抬起检测臂，用新的无尘纸擦拭上下基座。 

1.3 污染发生后的彻底清理
       当出现样品底座肉眼可见的残留（如遗留在基座上的干燥样品），需使用0.5M的稀盐酸（HCL）按照1.2步骤进行初次清理，然后用去离子水执行1.2流程。

二、检测基座的修复（Reconditioning the Pedestals）
       NanoDrop One、NanoDrop OneC微量紫外可见光度计是利用液体表面张力作用，通过特殊样品滞留系统（液体接触界面），使微量液体在上、下基座间的空隙形成一个细小液柱。上基座内嵌入的光纤线缆连接氙灯光源，下基座内嵌入的线缆连接检测器。检测臂降下时，光从上而下通过液柱到达下底座进入检测器，从而生成吸光度与样品光吸收光谱数据曲线。
       拉伸光学液柱的测量技术对液体表面张力特征存在依赖。表面张力大的样品可以正常检测，而表面张力小，样品容易出现液柱拉断，使测量失效。
       已知测试样品的温度（温度升高表面张力减小）、盐分含量（水溶液加入无机盐后表面张力增大；而低盐溶液，如脱盐后的蛋白溶液，表面张力要减少）、非极性溶剂（一般指烷烃，如正己烷、庚烷、苯、甲苯等），表面活性剂/去污剂（如SDS、Triton X100、消泡剂存在的液体样品，表面张力降低）残留等多种因素均可显著样品溶液表面张力。

       此外，与液体接触的基座表面的疏水状态，对液体获得足够大的表面张力极为关键。
       正常使用情况下，随着使用时间推移，NanoDrop检测基座的表面也可能会失去其“已调节”的属性，特别是在使用含有异丙醇或表面活性剂（如Bradford法蛋白定量试剂）的溶液测量后(The pedestal surfaces may lose their “conditioned” properties over time, especially after measurements with isopropyl alcohol or solutions that contain surfactants or detergents such as the Bradford reagent. )，基座表面处于未调节（unconditioned）的状态。“未调节”基座会导致滴加在下基座的液滴“变平”，在检测臂降下时阻碍正常形态液柱的形成，由此产生的光谱可能看起来显得“粗糙”或呈“锯齿状”。
       因此，检测基座需要定期维护以保持检测的完整性。这一点适用于所有NanoDrop系列单道（如NanoDrop 1000、NanoDrop 2000/2000C、 NanoDrop One/One C、NanoDrop Lite、NanoDrop Lite Plus）、多道（NanoDrop 8000、NanoDrop Eight微量紫外可见光度计。
       无论何时，当液滴样品在基座上呈现扁平形状（而不是串成“微珠”或形成饱满的圆形液滴），或液柱在检测期间碎裂，则须立即对基座修复以恢复其表面疏水特性。

2.1 专用基座修复试剂法
       基座修复需用到无绒实验室无尘纸、移液器(0–2.5μL)和PR-1基座修复试剂盒。PR-1 基座修复试剂是一种专门配制的调整化合物，涂抹到样品基座工作表面以恢复其疏水状态。
       修复基座操作步骤为：
1）用点样棒蘸取PR-1基座修复试剂；
2）抬起检测臂并保持此状态，在上、下基座表面均匀的涂上薄薄的一层修复化合物，保持约30秒使PR-1化合物自然挥发干燥；
3）将干净的实验室无尘纸折叠成合适大小，一只手支撑检测臂避免损坏检测臂，擦拭上下基座表面。正常情况下，无尘纸变为黑色，代表附着在基座表面的污渍被有效去除；
4）重复步骤3，直到上下基座表面擦拭干净为止；
5）用洗耳球等吹扫去除残留在基座上的任何纸屑及杂质；
6）验证修复效果：将1μL去离子水滴加至下基座，水珠串成“微珠”或形成一个圆形液滴，即代表基座成功复性。

2.2 稀盐酸修复法
       PR-1 基座修复化合物是修复基座最简单的方法。如果实验室并无PR-1试剂盒储备，则可用HCL和去离子完成修复工作，操作步骤如下：
1）抬起仪器检测臂并将 3μL 0.5M HCL滴加至下基座；
2）降下检测臂并保持2–3分钟；
3）抬起检测臂，用实验室无尘纸擦拭上下基座；
4）将 3μL 去离子谁滴加至下基座，以清除HCL；
5）降下检测臂并保持2–3分钟；
6）抬起检测臂，用无尘纸擦拭上下基座；
7）用洗耳球等吹扫去除残留在基座上的任何纸屑杂质。

参考文献：
NanoDrop Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Rev. E)
NanoDrop 微量紫外/可见光分光光度计用户手册 (Rev. B)
Solvent Compatibility and Utility（Nanodrop Instruments Technical Bulletin）