实时荧光定量PCR实验注意事项

1.在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 断裂。
2.为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3.内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4.PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5.防止 DNA 的污染：采用 DNA 酶处理 RNA 样品，在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA 的共线性。
6.所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
7.塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
8.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在 3% H2O2 室温 10min，然后用 0.1% DEPC 水冲洗，晾干。
9.配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC，在 37℃处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
10.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换，尽量避免其他人员干扰。
11.设置 RNA 操作专用实验室，所有器械等应为专用。
12.DEPC 是蛋白质强变性剂,它和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。具强挥发性，致癌物，因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。
13.RT试剂盒从冰箱拿出，应该充分解冻，瞬离后，混匀，放于冰上，可在冰上加样。试剂可以用数字贴纸编号，避免漏加、错加试剂。
14.取用不同的试剂时，必须更换枪头，样本之间要避免交叉污染。
15.逆转录时，PCR仪可以先预热。
16.反应体系配好之后，应充分混匀，瞬离，并且弹去管内的气泡。
17.实验过程中应预防RNA酶污染，使用无酶枪头以及EP管，同时台面可以使用固相RNA酶去除剂清洁。
18.PCR时，管壁尽量避免写字。
19.管盖一定要盖严。
20.10μL逆转录反应体系建议加入不超过500ng的RNA。
21.如果目的基因表达量非常低,最多加入1μg Total RNA,否则加入RNA量过高,可能会超出后续PCR的线性范围。
22.反应体积可根据需要等比例放大。
23.试剂尽量不要反复冻融。
24.每个样品至少3个平行孔,所有成分加完后，离心去除气泡。
25.可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中。