关于机械性刺激对果蝇的睡眠诱导研究方法

美国托马斯·杰斐逊大学的研究团队通过果蝇实验发现，习惯性在单调刺激的睡眠诱导中发挥着至关重要的作用，对反复刺激的习惯化会降低唤醒感，并通过一种常见的机制增加睡眠倾向。

People tend to fall asleep when gently rocked or vibrated. Experimental studies have shown that rocking promotes sleep in humans and mice. However, the mechanisms underlying the phenomenon are not well understood. A habituation model proposes that habituation, a form of non-associative learning, mediates sleep induction by monotonous stimulation. Here, we show that gentle vibration promotes sleep in Drosophila in part through habituation. Vibration-induced sleep (VIS) leads to increased homeostatic sleep credit and reduced arousability, and can be suppressed by heightened arousal or reduced GABA signaling. Multiple mechanosensory organs mediate VIS, and the magnitude of VIS depends on vibration frequency and genetic background. Sleep induction improves over successive blocks of vibration. Furthermore, training with continuous vibration does not generalize to intermittent vibration, demonstrating stimulus specificity, a characteristic of habituation. Our findings suggest that habituation plays a significant role in sleep induction by vibration.

关于机械性刺激对果蝇的睡眠诱导研究方法：

1、睡眠分析

为了进行睡眠分析，将3至5天大的苍蝇进行12小时LD或恒定光照（LL）至少3天，并在装入试管后约2天测量基线睡眠。对于DD实验，将苍蝇带到LD直至装载，并在切换到DD后1-2天测量基线睡眠。大约将16只雄性和16只雌性放在一起，直到将它们分别装入装有5％蔗糖和2％琼脂的玻璃管中。实验均在25°C进行，果蝇在22°C饲养。在22°C监测1天以确定基线睡眠水平，在29°C监测1天以激活dTrpA1通道。使用果蝇在1分钟的容器中收集活动数据（光束中断） 活动监测（DAM）系统，用于测量睡眠状态，定义为持续至少5分钟的不活动时间（Huber等，2004）。除非特别指出使用多光束监视器，否则使用单光束监视器。对于多光束数据，“计数”设置用于检测组合的局部，光束内运动和光束间运动，而“运动”设置仅用于检测光束间运动。光束内运动通过从计数中减去运动来计算。使用自定义的基于MATLAB的软件SleepLab。

2、振动刺激的产生

将活动监视器，监视管和包含苍蝇的舞台放置在模拟多管涡旋仪（Fisher Scientific，Pittsburgh，PA）上方约40 cm的架子上，或使用螺钉固定在扬声器系统平台上（图S1 A和S6）一种）。将涡旋仪和扬声器系统放置在光温受控的培养箱中。对于涡旋实验，将强度设置为3，并通过LC4光控制器控制机械刺激的持续时间和时间。对于扬声器系统实验，使用定制的MATLAB GUI生成任意频率和幅度的音频信号。DAM活动监视器牢固地固定在丙烯酸平台上，该平台粘贴在15英寸船用低音炮的锥体上。一台PC将音频信号传送到为低音炮供电的放大器，从而驱动机械振荡。

3、视频录制和量化

对于视频S1将果蝇装到含有5％蔗糖和2％琼脂的7mm×16mm×4mm孔中。使用数码相机录制视频。为了对行为进行定量视频分析，将单个果蝇装入装有5％蔗糖和2％琼脂的标准DAM监测管（65 mm x 5 mm玻璃管）中。从ZT 1开始，对振动的第一个小时和上一个基准日的相应小时的行为进行手动评分。行为分类为睡眠（不活动时间大于5分钟），休息（不活动时间小于5分钟和> 10 s），运动，梳理和进食。持续时间少于10 s的不活动被分类为与侧翼期相同的行为。来自由两个人独立评分的两个实验的数据显示了相同的结果模式，

4、感官反应性分析

果蝇在持续适度的强光（〜500 lux）下被夹带后，暴露于变化持续时间（1 s，15 s和1分钟）的极亮光（〜15,000 lux）下。使用LC4光控制器，每隔30分钟在交替振动（1 h）和无振动（1或2 h）的过程中每隔30分钟施加一次明亮刺激。在第一个振动周期开始后的25分钟，开始进行一系列的光刺激。感官反应性的测量方法是：在刺激出现时在睡眠中的苍蝇在亮光刺激后2分钟内开始移动的百分比。在光刺激前10分钟对数据进行类似计算，以测量自发觉醒。在振动1小时和静音2小时的交替时间内，每小时施加一系列1分钟的暗脉冲，在第一次振动发生后45分钟开始。使用Excel确定在明亮或黑暗脉冲的2分钟内唤醒的熟睡蝇的百分比。

5、免疫组织化学

对于整个安装免疫染色，将雌性大脑在4％多聚甲醛（PFA）中固定60分钟。在PBT中洗涤3次（在PBS中为0.3％Triton-X）后，将切开的脑在1％的PBT中的正常山羊血清中于室温封闭1小时，并在4°C下与一抗孵育过夜。在PBT中洗涤3次后，将它们与二抗在4°C下孵育过夜。兔抗GFP以1：1500使用，小鼠抗BRP在1：200，Alexa Fluor 488山羊抗兔在1：1000和Cy5山羊抗小鼠（在1：1000。Leica SP8共焦显微镜用于图像处理。

6、天线消融

使用3毫米Vannas弹簧剪刀将1至2天大的苍蝇的所有三个触角节段进行物理移除。恢复3天后，将苍蝇装入监测管进行睡眠分析。

7、转基因蝇系

为了生成UAS-Gad1 shRNA构建体，按如下所述设计在Gad1的编码区中包含两个21聚体（GAT TGT TGA TGT CGC GTA AGC和GGG TAT AAA CTG TCC GAG AGG）的215bp，由GeneArt合成。将合成的DNA插入pUAST载体中，并通过标准的种系转化在iso31背景下产生携带该构建体的转基因系。

8、量化与统计分析

统计测试使用GraphPad Prism 8进行，除了以下所述的双向重复测量方差分析。将Paired Student’s t检验与Bonferroni校正配对使用，以确定振动是否引起睡眠和活动的显着变化。为了比较成对的天线对（如触角消融蝇和完整蝇），进行了未配对的Paired Student’s t检验，并且为了比较3个或更多的组，进行了方差分析。如果各组的方差不相等，则使用Welch t检验进行方差不均或使用方差分析的Brown-Forsythe和Welsh版本。在进行方差分析后，根据事后检验的类型和数量，进行了Dunnett’s或Sidak’s的检验。进行Wilcoxon配对对带Bonferroni校正的正负秩检验，以分析睡眠发作持续时间数据。为了分析亮脉冲和暗脉冲的可唤醒性，进行了χ平方检验，然后对多个检验进行了Bonferroni校正。比较连续振动和间歇振动图5中，使用SAS v9.4执行了两次重复测量方差分析，其中训练块为对象内因素，连续和间歇振动块的顺序为对象间因子。主要因素之间的所有相互作用都是显着的，并且使用Bonferroni方法对选定的事后比较进行了多次比较的校正。统计测试的详细信息，包括p值和n，可以在图例中找到。所有实验均使用独立杂交的果蝇进行了至少两次。

本研究所需试剂：

多肽和重组蛋白、兔抗GFP 分子探针 、小鼠抗BRP、Alexa Fluor 488山羊抗兔、Cy5山羊抗小鼠 、16％多聚甲醛水溶液、普通山羊血清

仪器耗材：监测系统、单束监测仪 、果蝇活动监测系统、多束监测仪、LC4灯光控制器、涡旋仪、培养箱、显微镜

论文链接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(20)31451-0?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124720314510%3Fshowall%3Dtrue