PCR实验中扩增得率低或无扩增问题及解决方法

可能原因及解决方案

一、DNA模板

1、完整性较差

建议方法：

1）在分离DNA时，尽量减少对DNA的切断或切刻。如有需要，可通过 凝胶电泳检测模板DNA完整性。

2）将DNA保存于 分子级别的水 或 TE缓冲液 （pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。

2、低纯度

建议方法：

    1）使用纯化试剂盒分离模板DNA时，应严格遵循试剂盒生产商的建议。查阅用户手册和疑难问题指南，改善较低的DNA质量。

2）如果采用化学或酶促DNA纯化方案，应确保无PCR抑制剂残留，如苯酚、EDTA和蛋白酶K。

3）使用70%乙醇再纯化或沉淀和洗涤DNA，去除可能会抑制DNA聚合酶的残留盐分或离子（如， K+, Na+等）。

4)选择具有 高合成能力的DNA聚合酶，这类聚合酶对土壤、血液和植物组织携带的常见PCR抑制剂具有较好的耐受性。

3、用量不足

建议方法：

1)检查 DNA起始量 ，如有需要适当增加起始量。

2)选择具有 高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。

3)适当增加PCR循环数。

4、复杂的目的片段（如，高GC含量或含二级结构）

建议方法：

   1)选择具有 高合成能力的DNA聚合酶，这类酶对DNA模板的亲和力较高，更适合扩增困难靶标。

2)使用 PCR添加剂或辅助溶剂 ，促进富含GC的DNA和具有二级结构的序列变性。

3)增加 变性时间或温度 ，从而高效解离双链DNA模板。

5、长片段

建议方法：

1)确认所选DNA聚合酶的长片段扩增能力。使用专为 长片段PCR设计的DNA聚合酶。

2)选择具有 高合成能力的DNA聚合酶，这类酶能够在短时间内扩增长片段。

3)降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性。

4)根据扩增子长度，增加延伸时间

二、引物

1、设计存在问题

建议方法：

1)查看 引物设计。使用在线 引物设计工具 。

2)确保引物针对目的片段具有特异性。

3)确认引物与正确的目标DNA链互补。

2、引物陈旧

建议方法：

1）将引物重悬和分装，并 妥善保存。

2）将新鲜的引物分装，或按需购买新的引物。

3、用量不足

建议方法：

1）优化引物浓度（范围通常为0.1–1 μM）。

2）对于长片段PCR和使用简并引物的PCR，最小起始浓度为 0.5 μM。

 三、其它反应组分

1、DNA聚合酶不合适

建议方法：

1）使用热启动DNA聚合酶，防止校正DNA聚合酶的3’→5’核酸外切酶活性导致引物降解。热启动DNA聚合酶还能消除非特异性扩增，从而提高目的PCR产物的得率。

2）或者，在冰上配制PCR反应体系，或在反应混合物中最后添加DNA聚合酶。

2、DNA聚合酶用量不足

建议方法：

 1）选择具有 高灵敏度 的DNA聚合酶用于扩增。

2）核对PCR使用的 DNA聚合酶推荐用量，并根据需要进行优化。

3)如果反应混合物含有高浓度的添加剂（如，DMSO、甲酰胺）或样品来源抑制剂，可提高DNA聚合酶用量。

3、Mg2+ 浓度不足

建议方法：

1)优化 Mg2+ 浓度，以获得最高的PCR得率。若存在EDTA、其它金属螯合剂或非寻常的高浓度dNTP，则需要提高 Mg2+浓度。

2)查看DNA聚合酶对镁盐溶液的偏好性。例如， Pfu  DNA聚合酶与MgSO4 结合使用的效果比 MgCl2更好。

4、PCR添加剂或辅助溶剂过多

建议方法：

 1)查看PCR添加剂或辅助溶剂的 推荐浓度 。尽量使用最低浓度。

2)调整退火温度，因为高浓度的PCR添加剂或辅助溶剂会削弱引物与目的片段的结合。

3)增加DNA聚合酶用量，或使用具有 高合成能力的DNA聚合酶。

4)考虑使用专为指定DNA聚合酶设计的特殊添加剂或辅助溶剂（如， Invitrogen™ Platinum™ DNA聚合酶附带的GC增强剂）

5、反应混合物中的dUTP或经修饰的核苷酸

建议方法：

1）确保选定的DNA聚合酶能够掺入经修饰的核苷酸。

2）优化经修饰的核苷酸与dNTP的比例，从而提高PCR扩增效率。

6、不均匀的试剂

建议方法：

 1）将试剂储液与制备反应组分充分混合，消除保存和反应配制期间可能形成的密度梯度。

四、热循环条件

1、变性效果不理想

建议方法：

1）优化 DNA变性 时间和温度。变性时间短、温度低可能无法获得良好的双链DNA模板解离效果。相反，变性时间长、温度高可能会降低酶活性。

2、退火效果不理想

建议方法：

1）尽量使用 梯度热循环仪 ，以1–2°C增量逐步优化退火温度。最佳退火温度通常比最低引物Tm低 3–5°C。

2）当使用 PCR 添加剂或辅助溶剂 时，应调整退火温度。

3）使用指定DNA聚合酶在其最佳缓冲液中的 推荐退火温度 。DNA聚合酶不同，则引物对的退火温度也不同。

3、延伸效果不理想

建议方法：

1）选择适合于扩增子长度的延伸时间。

2）在扩增长片段（如，>10 kb）时，降低延伸温度（如，降至68°C）可保持酶活性。

3）使用具有 高合成能力 的DNA聚合酶，在较短的延伸时间内也能实现 稳定的扩增 。

4、PCR循环数不合适

建议方法：

1）调整循环数（通常为23-35个循环），以获得合适的PCR产物得率。如果DNA起始量低于10拷贝，则将循环数增加至40。