操作规程
外泌体超速离心分离法基础操作流程1 (译稿)
阿拉斯加科技(北京)有限公司编译（Ver.202309）
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指从细胞质膜（plasma membrane）上脱落或由细胞分泌的有脂质双层膜、内部包裹有核酸、蛋白和脂质等多种生物活性大分子的囊泡微粒。按囊泡膜起源的不同，细胞外囊泡一般分为外泌体（exosome, EXO）、微囊泡（microvesicle, MV）和凋亡小体（apoptotic body, AB）3大类。微囊泡是由细胞膜直接出芽形成的细胞外囊泡，体积相对较大，直径100 - 1000 nm之间。凋亡小体是在细胞凋亡过程中产生，由胞膜皱缩内陷、分割包裹一团胞质中DNA及细胞器后形成的囊泡，体型最大，直径100 - 5000 nm。外泌体是胞外囊泡中体积较最小的一种，由细胞内多泡内体(multivesicular endosome, MVE)与质膜融合后通过胞吐作用释放到细胞外，直径30 - 150nm不等。
可见，细胞外囊泡的来源和分子组成具有异质性。而同时，不同微小囊泡群体（如外泌体和微囊泡）在大小、内容物、膜成分等生物物理学表型上又存在一定程度的重叠，将不同亚群完全分离纯化在方法学尚有困难。因此，国际细胞外囊泡协会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）在2018年研究指南中建议，在正式学术文件中将“exosomes（外泌体）”用“small EVs (sEVs)”(小细胞外囊泡)来表述，微囊泡和凋亡体则标注为“medium EVs /large EVs” (m/lEVs)。
细胞外囊泡充当细胞间通讯和物质交换的介质，在许多生理和病理过程中起着关键作用。其中，对外泌体的研究近年呈现爆发式增长态势。但高纯度和足够数量的外泌体分离制备在技术上充满挑战。
国际细胞外囊泡协会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）2016年10月份发布的用于细胞外囊泡隔离和表征的技术的首次全球调查报告——《Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey》中显示，条件细胞培养基是使用最广泛（83%受访者）的外泌体分离起始样品材料，而超速离心则是最常用的分离方法（81%的受访者）。
外泌体超速离心分离法基础操作流程中文译稿，据法国居里研究所G. Raposo、A. Clayton等2006 年在Current Protocols in Cell Biology发表的《Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids》一文中Supplement 30 unit 3.22一节内容编译而成。为方便阅读，对原文表格、图片和编排等局部略有改动。
一、细胞培养基来外泌体分离样品离心操作流程示意图
二、Current Protocols in Cell Biology 2006版外泌体超速离心分离基础流程
Basic Protocol 1 for the exosome purification procedure based on differential ultracentrifugation
【实验材料】 |
调节培养基（Conditioned medium, CM）（制备方法见支持协议1步骤5） |
PBS缓冲液 |
TBS缓冲液(可选) |
低温离心机 |
50mL聚丙烯离心管 |
立式超速离心机（如Beckman Optima L-XP、Optima XPN和Optima XE系列）、角转头或水平转头 |
立式超离转头配套异质聚合物超速离心管或PC透明离心瓶 |
微量移液器 |
台式超速离心机（如Beckman TL-100、Optima MAX-XP和Optima MAX-LT）及配套转头 |
-80℃超低温冰箱 |
【注意事项】 |
所有离心都应在4℃下进行。 |
如只进行生化分析（如免疫印迹、蛋白质组学、FACS分析等），离心管无菌即可，样品非必须执行灭菌操作。 |
有当外泌体的最终应用（如用于体内或体外功能检测）须达到无菌状态时，需使用灭菌设备处理样品。 须使用无菌超离心管，样品操作在洁净操作台内进行。 超离心管和管盖消毒可用用70%乙醇浸泡、冲洗后，用无菌PBS冲洗两次后将PBS清除干净后密封备用。 超速离心角转头的转头盖同样需经70%乙醇清洗处理后，在超净台无菌环境下完成装样和转头密封操作。 |
操作步骤】 |
【清除细胞和细胞碎片】 这一阶段用低温高速离心机，分三次以300xg、2000×g和10000xg顺序差速离心的方法，去除活细胞，死细胞和细胞碎片。操作共5个步骤，每步需将离心管中沉淀抛弃，留上清用于下一步操作。 |
1. 收集经调节培养基培养的细胞，转移至50mL尖底离心管中，300×g离心10分钟，去除沉淀，收集上清。 |
2. 上清经低温离心机上水平转头2000×g离心力4℃离心20分钟。 |
3. 用移液器在距管底沉淀上方0.5cm处，小心采集上清。避免直接倾倒上清，确保上清不被沉淀颗粒污染。 上清转移到适合于超离心转子多聚异构体管或PCR离心瓶中（备注：当缺少可用于50 - 100mL管10000×g离心的低温高速离心机及相应转子时，将该步骤转移至超速离心机上进行；如实验室离心条件具备，亦可直接用低温高速离心机转头及配套离心管离心）。 用防水记号笔在超速离心管底部沉淀发生一侧做好沉淀物位置标记。 |
4. 将理性带标记一侧朝上安装到转头中，10000×g离心力4℃离心30分钟，沉淀细胞碎片。 |
【收集含外泌体组分】 从第一阶段处理所得上清中4℃超速离心沉淀，收集包含细胞外囊泡和可溶性蛋白污染物的外泌体初提物。 |
5. 将步骤3离心后的上清转移到一新超速离心管中。 若步骤3离心后无明显可见的颗粒出现：使用的是水平转头离心则颗粒必聚集在管底部。若用角转头处理，则沉淀位于管的记号笔标记侧靠近管底部位置。 添加 PBS填充，使所有管中样品容积不低于管最大容量的3/4（配平以确保离心管总重量一致，下同）。 用移液管取出上清液时，将试管保持一定角度，使沉淀始终覆盖有上清液，液面降低至离沉淀高度0.5cm处停止移液（剩余上清废弃处理，以避免吸入沉淀颗粒污染）。 |
6. 4℃ 下100000×g离心至少 70 分钟（1小时+10分钟）。 离心时间从离心力达到100000×g开始计算。 离心时间延长至3小时不会损害外泌体。 |
7. 完全去除上清，收集沉淀。 角转子离心后，可直接倾倒出上清。 水平转子离心，须用移液管除去上清，并保留沉淀上方2 mm上清（以避免损失沉淀）。 |
【清洗外泌体】 初步分离获得的外泌体组分含有较多可溶性蛋白污染组分。此阶段通过大量PBS漂洗，再经第二轮超速离心，去除可溶性蛋白污染成份。 |
8. 用微量移液器在1mL PBS缓冲液中重悬沉淀，将来自同一细胞材料的所有离心管重悬液集中在一个离心管中。然后加入PBS将完全填充满。 这一步中可能因沉淀颗粒少而无明显可见的颗粒。定角转头离心的样品管管，在颗粒应该生成管底靠外侧位置上下冲洗来重悬。水平转头离心时，充分冲洗管底部，以确保样品回收率。 |
9. 4℃ 下100000×g离心满1 小时。 |
10. 完全移除上清 角转子离心后，可直接倾倒去除上清液后，再将试管倒置并用移液器吸出管侧面和管口处剩余液体，以尽可能完全除去上清液。 视沉淀量多少而定，继续进行步骤11a |
11a. 如形成有沉淀（沉淀体积约调节培养基初始体积的1/2000。50mL培养基对应于25μL沉淀），则加入50-100μL PBS或TBS缓冲液重悬沉淀（即外泌体成品）。 |
如步骤10中沉淀最终体积超过调节培养基初始体积的1/2000或没有可见颗粒，则进行步骤11b操作。 |
11b. 外泌体样品浓缩 上清用台式超速离心机TLA-100.3转子和厚壁开口管4℃下100000×g离心1小时后，完全去除PBS上清液，所得沉淀用新鲜20-50μL PBS重悬 |
【外泌体样品保存】。 |
12.将各管中样品以PBS统一定容至100μL后 -80℃储存。 可有效保存1年。 但存储期间应避免发生反复冻融 |
三、基础流程1局部替代流程（Alternate Protocol of Basic Protocol 1）
过滤替代离心消除大细胞碎片和膜 |
对于某些细胞（如小鼠树突状细胞）来源样品（如脑脊液），可用0.22μm过滤器一个过滤步骤替代基础流程1中的步骤1-6操作用于除去死细胞和大细胞碎片，同时保留了液体中的微小囊泡，以便通过超离心进纯化。 这个流程局部替代方案是否可行，需使用相同体积的调节培养基、采集相同细胞、在同一时间分别用两个流程分离外泌体后，通过比较两种流程所得外泌体的收益率和质量方能验证。 |
材料（参见基础流程1）： 0.22-μm过滤器灭菌装置（如Steritop; Millipore）； 100mL - 1L玻璃瓶，无菌； |
操作方法： 1. 通过在无菌瓶上连接真空的0.22μm过滤器对调节培养基进行除菌处理； 2. 过滤后的上清，如不立即进行外泌体分离，则至多可在4℃下保存1周（上清4℃超过一周可能会导致一些外泌体的丢失）； 3. 余下的分离外泌体操作步骤与基础流程中步骤8 – 12相同。 |
四、纯化外泌体中超速转头及工作参数设置
Beckman Ultracentrifuge Rotor Information for Exosomes Purification
可用机型 | 超速离心转头 | 离心管材质/容量 | 10k×g时转速 | 12k×g时转速 | 100k×g时转速 | 110k×g时转速 |
立式超速离心机 Optima XPN-100 Optima XPN-90 Optima XPN-80 Optima XE-100 Optima XE-90 | SW 41 Ti甩平转头 SW 40 Ti甩平转头 | PA管/12mL | 7500 rpm | 8200 rpm | 24000 rpm | 25000 rpm |
SW 28 Ti甩平转头 SW 32 Ti甩平转头 | PA管/30mL | 7500 rpm | 8200 rpm | 24000 rpm | 25000 rpm | |
Type 70 Ti角转头 | PC瓶/22mL | 10000 rpm | 11000 rpm | 31000 rpm | 32000 rpm | |
Type 45 Ti角转头 | PC瓶/68mL | 9000 rpm | 10000 rpm | 30000 rpm | 31000 rpm | |
台式超速离心机 Optima MAX-XP Optima MAX-TL | TLA-100.3角转头 | Thick-wall管/3mL | 13000 rpm | 15000 rpm | 43000 rpm | 45000 rpm |
TLA-110角转头 | PC瓶/5mL | 15500 rpm | 17000 rpm | 49000 rpm | 51400 rpm |
五、支持流程2：制备外泌体生产培养基
外泌体通常存在于用于组织培养的血清中。为避免这些外泌体污染，用于培养细胞的调节培养基的培养基必须去除污染外泌体。
去除血清衍生外泌体培养基有两种选择：
（1）如果细胞能在无血清条件下正常生长，外泌体生产培养基可以作为基础培养基，补充所有营养物质和抗生素（胎牛血清FBS除外）；如细胞需要一些蛋白质才能存活，可添加1%（w / v）牛血清白蛋白BSA代替FBS。
（2）如果细胞在无血清条件下不能存活，请按照此流程从含FBS的培养基中去除FBS来源的外泌体组分，以获得排空FBS外泌体的外泌体生产培养基（predeplete the FBS-derived exosomes from FBS-containing medium）。
材料 |
含有所需营养素（例如抗生素、L-谷氨酰胺、HEPES、2-巯基乙醇、FBS）的培养基 |
超速离心机和固定角度或水平吊斗转子 |
适用于超速离心机转子的聚异构体管或聚碳酸酯瓶 |
0.22 μm 过滤灭菌装置（如密理博Steritop） |
100mL至1升玻璃瓶，无菌 |
操作步骤 |
1. 准备已补充所有营养素的基础培养基，添加20% （v/v） FBS。 |
2. 超速离心排空外泌体 将培养基4℃下100000×g离心过夜（overnight）。 新鲜细胞培养基用SW 28或SW 32甩平转头4℃下100000xg超速离心70分钟，沉淀培养基内自带外泌体颗粒。 如使用可重复使用的离心瓶进行外泌体排空操作，则外泌体分离操作与FBS培养基排空操作的离心瓶不得混用，以避免潜在血清内体（serum endosomes）污染。 |
3. 过滤除菌 |
将离心瓶内上清倒入与真空泵连接的无菌0.22μm瓶顶滤器中，启动培养基进行除菌处理。 |
注意离心管中沉淀颗粒，确保它不会松动混入。 |
4. 稀释培养基 |
稀释过滤后的培养基，使FBS的最终浓度符合外泌体生产培养基的要求。 |
如细胞通常在10% FBS中培养，则用1倍体积的无FBS培养基稀释排空外泌体处理的FBS培养基。 |
请勿使用纯FBS进行外泌体排空操作，因纯FBS粘度大，超速离心导致纯FBS所携带的对细胞生长有利的蛋白质和细胞因子聚集沉淀。 |
5. 离心排空外泌体处理并过滤除菌的培养基在4℃下保存时有效期不超过4周。因此，应在此期间完成外泌体分离实验。 |
参考资料：
［1］Clotilde Théry, Sebastian Amigorena, Graça Raposo, Aled Clayton. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006; Chapter 3: Unit 3.22.
［2］Clotilde Théry, Kenneth W Witwer,£ Elena Aikawa,et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018; 7(1): 1535750.
［3］Clotilde Théry, Sebastian Amigorena, Graça Raposo, Aled Clayton. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006; Chapter 3: Unit 3.22.
