操作规程
多区肝脏类器官实验报告信息与欧盟MIAOU标准的对照分析
2025年4月16日， Nature 刊发了题为《用人多能干细胞生成的多区肝脏类器官》(Multi-zonal liver organoids from human pluripotent stem cells)的研究报告（以下统一简称为“多区肝脏类器官”），宣告肝脏类器官实验技术实现了里程碑式跨越——具有类似于人体肝细胞代谢区域化特征的多区人肝类器官的诞生。文章出自美国辛辛那提儿童医院Takanori Takebe领导的研究小组，最早于2024年8月30日以“Self-Assembled Generation of Multi-zonal Liver Organoids from Human Pluripotent Stem Cells”题名在bioRxiv在线发表。有趣的是，此文的通讯作者Takebe，正是《Nature》2013年一篇Research Letter《Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant》、2014年7月 Nature Protocols Article《Generation of a vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant》的第一作者。
2024年开发的多区人肝类器官[1]与2013年构建人肝脏类器官[2-3]比，在关键技术上的迭代3点。首先，鉴于人类和其他灵长类动物细胞的L-抗坏血酸合成酶基因，L-古洛糖酸内酯氧化酶（L-gulono-γ-lactone oxidase, GLO），发生了严重突变，缺少了啮齿动物基因序列中存在的多个外显子而成为一个假基因(pseudogene)，导致体内自行合成L-抗坏血酸（维生素C）。故用AAV载体将搭载了小鼠 Gulo (mGulo)基因的四环素(TET)诱导表达系统敲入人hiPSC细胞，以激活门静脉周围肝细胞的身份。第二，先分别构建门管区肝类器官和中央静脉周围肝类器官后，再将两个类器官共培养，经自我组装和融合，衍生了具有三分区的类器官组装体。第三，也是最根本突破，在于类器官组装体具备了人体肝脏那样沿门管区-中央静脉轴细胞代谢功能分区的特征。
我们简单回顾一下肝类器官技术的历程，就很容易理解多区人肝类器官技术的进步价值。
一、多区肝类器官组装体之前的肝脏类器官技术研究进展
肝脏由肝实质细胞（parenchymal cells）和肝脏非实质细胞 （Liver non-parenchymal cells, NPC）组成。肝实质细胞，即肝细胞(Hepatocyte)执行，构成肝脏质量的 80% 和细胞组成的 60%是肝代谢功能的主要承担者。肝脏非实质细胞起支持肝细胞功能的作用，有多种细胞类型，包括肝内皮细胞（liver endothelial cells, LEC）、肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)、胆汁上皮细胞或胆管细胞(biliary epithelial cells or cholangiocytes)、库普弗细胞(Kupffer cells)和其他免疫细胞群。
人体肝实质与非实质细胞在空间上排列成六边形的肝小叶（liver lobules），是肝脏结构和功能的基本组成单元。肝动脉的分支——小叶间动脉血富含O2、激素（如胰岛素和胰高血糖素）及代谢产物。门静脉的分支——小叶间静脉血提供从胃肠道吸收的葡萄糖、脂肪酸、维生素等营养和药物成份。氧气、激素和营养物质的血液从肝小叶的门管区（portal area）进入，在肝小叶内部血窦（hepatic sinusoid, LU）、窦周隙（persinusoidal space, PS）内进行物质交换后汇入中央静脉（central vein, CV）。而经干细胞转化生产的胆汁酸则进入胆小管从小叶中心向门管区流动并排出肝脏[4]。
此前，体外构建肝脏类器官主要有肝细胞胆管类器官、血管化肝类器官和肝脏类器官芯片三种类型，技术定位于尽可能模拟肝脏的组织构造和蛋白质合成、胆汁分泌等基本生理功能。
2015年，科学家用人肝脏分离的原代人EpCAM+细胞经体外悬浮培养成功构建出具有典型胆管状结构肝脏类器官[5]。此后，用人胚胎干细胞诱导分化的肝祖细胞经三维培养建立了肝脏类器官，不仅具有肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4 alpha, HNF-4α)、细胞色素P450 家族1亚家族A1成员 (cytochrome P450 family 1subfamily A member 1, CYP1A1)、白蛋白(albumin)、三磷酸腺苷结合转运蛋白C 超家族成员2(ATP-binding cassette subfamily C member 2, ABCC2) 等成熟肝细胞典型标志物，还在解热镇痛药物乙酰氨基酚（acetaminophen,APAP）肝毒性测试中表现出类似于原代肝细胞（Primary Human Hepatocyte, PHH）的剂量依赖反应[6]。
缺少血管循环网络的肝脏类器官与真实肝脏生理环境尚有差距。为此，研究人员进行了构建具有血管化结构肝脏类器官的尝试。Takanori Takebe等将iPSC诱导形成的肝内胚层细胞、人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC）和人骨髓间充质干细胞 (human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)共同培养，生成具有三维球状组织的肝芽(liver bud)——人血管化肝脏类器官。将其移植入免疫缺陷的小鼠体内48小时后,肝芽与宿主血管互连形成复杂血管网络, 并实现血管网有效血液灌注[2,3]。
在静态培养体系构建血管化多细胞类型肝类器官基础上，近年，肝脏类器官芯片陆续面世，以适应肝癌、非酒精性脂肪肝的基础研究和高通量抗肝癌药物筛选体外模型应用需求。肝血窦芯片含有类似肝脏的血流环境和维持肝脏生理功能的多种细胞类型，可通过微流控技术动态调整液体流量及物质输送。而基于肝小叶的生理结构和功能，构建包含门静脉、肝动脉和中央静脉三条血管通道和六棱柱体式细胞培养室的肝小叶芯片，不仅具有多样化细胞组成类型，还实现了肝门静脉和肝动脉实现双重供血。运用肝小叶类器官芯片首次模拟了非酒精性脂肪性肝病（non -alcoholic fatty liver disease, NAFLD）中肝小叶中的脂质分区进展[6]。
多区肝脏类器官的研究愿景并建立可用于糖尿病、药物性肝损伤、酒精相关肝病等疾病发病机制和肝病药物筛选模型的体外细胞模型，而是实现用患者自体细胞培养出能取代异体捐赠肝脏、直接用于肝移植治疗的再生医学目标。这要求用人类干细胞衍生出的肝类器官与人体肝脏组织结构、细胞组成类型、代谢功能（包括谷氨酰胺合成、氨代谢、尿素循环、脂质和葡萄糖等）完整性、血液与胆汁流向与人体肝脏的高度一致。
二、多功能区肝脏类器官组装体技术的开创性
血液、胆汁酸从肝小叶外围的门管区到中央静脉区流动是一个复杂物质交换过程。沿门管外围-中央静脉外围轴（periportal-pericentral axis），形成氧气、营养物质、激素及代谢废物浓度的梯度分布区，即：血流中O2、葡萄糖、胆固醇（Cholesterol）等营养物质浓度从肝小叶外缘向中央静脉方向梯次降低，而激素及氨、胆汁酸(Bile acid)、尿素等代谢物的浓度则在这一方向上渐次升高[4]。
与物质浓度梯度分区模式相应的是，肝小叶内部的葡萄糖异生作用(gluconeogenesis)、脂肪酸β氧化(β-oxidation)、尿生成(Ureagenesis)、蛋白质分泌(Protein secretion)和糖酵解（glycolysis）、脂肪生成（lipogenesis）、谷氨酰胺合成（Glutamine synthesis）等代谢功能，沿着物质梯度轴呈现异质性（hepatic functional heterogeneity），或称为代谢通路的空间区室化（spatial compartmentalization of metabolic pathways）。譬如，门静脉周围肝细胞中糖异生和脂肪酸氧化的活性较高，中央静脉周围细胞中的糖酵解和药物代谢升高。在哺乳动物肝脏中，肝细胞的代谢和功能因在肝小叶内的位置不同而存在差异，即肝细胞功能空间异质性，称为肝脏分区（zonation）。科学界通常将肝小叶内部差异化代谢功能区分为三个，即围绕肝动脉和门静脉区域的门管周边区(periportal areas, zone 1)，靠近中央静脉的中央静脉周边区(pericentral areas, zone 3)和介于这两者之间的小叶中间区(mid-lobular areas, zone 2)。门静脉区（1区）执行糖原和胆固醇的合成、胆汁酸代谢和氨转化为尿素的功能，参与糖原储存和胆汁酸代谢。中央静脉周边区域（3区）细胞执行CYP450酶主导的解毒和药物代谢，脂质氧化反应和谷氨酰胺合成。而处于1、3区之间的肝小叶中间区（2区）为功能过渡区，兼1区、3区部分功能，具肝再生潜能。涉及肝脏分区的非肝实质细胞专属，肝血窦内皮细胞和窦周隙的肝星状细胞集群同样呈现出梯度变化，其基因表达和染色质可及性在不同区域存在显著差异[4, 7-8]。
肝小叶内部养分与代谢物浓度梯度分布的生理微环境（microenvironment）塑造了肝细胞分区，造成肝分区细胞表观遗传特征，如DNA甲基化或染色体构象的差异，决定了肝细胞基因表达谱和生理功能的空间异质性。大量研究表明，包括胆红素、代谢激素、O2、营养物质和形态发生素(morphogen)浓度等多种因素，通过激活Wnt家族分子（与3区肝细胞正确分区有关）、Hedgehog和Notch信号通路（与1区肝细胞和胆管细胞分区有关），调控了肝脏相关代谢功能基因的表达，决定肝细胞代谢区带命运。[7,8]迄今为止，决定细胞分区命运的主要转录调节因子未明确。在体外复制动物和人类肝脏功能分区的多细胞类型类器官的探索，在科学界尚无先例。
表观遗传学和转录组学分析显示，肝脏细胞的3分区是由抗坏血酸或胆红素依赖的内源性组蛋白乙酰转移酶p300与甲基胞嘧啶双加氧酶TET1（通过将 5-甲基胞嘧啶羟化成 5-羟甲基胞嘧啶完成DNA的主动去甲基化修饰）或低缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF1α)机制调控的。L-抗坏血酸（Ascorbic Acid）即维生素C（Vitamin C），可调节肝脏1区多个特异性肝细胞基因的表达，增强包括糖异生、胆固醇合成和脂肪酸氧化等功能，同时抑制3区肝细胞的脂生成。因此，采用稳定的抗坏血酸暴露可以促进靠近门管区细胞特定代谢途径基因的表达[1]。
胆红素（Bilirubin）是血液中衰老红细胞中的血红素经脾脏代谢后生成代谢废物，经肝脏转化为胆汁酸经胆管排放入肠道后随着粪便排出体外。胆红素可以直接或通过Wnt信号激活间接促进第3区特异性CYP酶的表达，增强位于3区域代谢活动的潜力。胆红素也能激活HIF1α的转录和翻译，模拟低氧条件效应，维持第3区特异性程序的表达。
基于胆红素和抗坏血酸能够通过促进表观遗传和转录程序的发展而定义了肝细胞分区身份的认识。研究人员采用L-抗坏血酸（主要靶向1区细胞）-胆红素（主要靶向3区细胞）的简单组合，分别对诱导两组来自人诱导多能干细胞诱导生成肝祖细胞，再通过共培养的富含抗坏血酸培养基、胆红素培养基暴露的肝祖细胞，生成自组装、精确模拟人体肝脏3分区细胞差异性表型的肝类器官组合体，标志着在实验室培养出准确模仿人类肝功能的肝组织技术实用化迈出了重要一步。移植人类类器官缓解接受胆管结扎、免疫抑制模型大鼠的高氨血症和高胆红素血症，提高了其生存率。
三、多区肝脏类器官组装体构建实验主要内容
多区肝脏类器官一文实验部分主要包括人源iPSC干细胞准备、Z1区、Z3区类器官培养和组合式夺区类器官构建、类器官功能表征的工作[1]。
3.1类器官的生成
人源iPSC干细胞材料准备：
干细胞材料中的对照组的1383D6 和 RCL-BC iPSCs 由京都大学 CiRA 友情提供。实验组iPSCs 72.3 和 72.3-GFP 是由阴茎包皮环切术废弃组织分离的成纤维细胞重编程为 iPSCs，并经慢病毒介导mGulo基因敲入改造而来。
类器官生成：
简言之，将p40 iPSC培养分化后，使用Accutase处理将细胞解离成单细胞悬液。将该单细胞悬液与50%基质胶和50% EP培养基混合，并在6孔板中接种后以产生类器官。
多区域人肝脏类器官组装体（mZ-HLO）的生成：
分别用低浓度胆红素、抗坏血酸处理未成熟的类器官生成GLUL+肝细胞Z3-HLOs，CPS1+肝细胞的Z1-HLOs，最后将Z3-HLO和Z1-HLOs类器官按数量1:2的比例共培养生成带有三个细胞区带特征的组合式多区域人肝脏类器官(mZ-HLOs)。收获的Z3-HLO、Z1-HLOs和mZ-HLOs用于下游表征分析。
3.2 多区域人肝脏类器官的主要表征内容
类器官活细胞延时成像：类器官实时成像，每30分钟成像一次，持续7天，观察类器官融合需要观察细胞骨架、脂质转运的功能。
类器官免疫染色成像：类器官免疫组化方法处理，在共聚焦激光扫描显微镜上成像。
蛋白表达检测：将类器官解离裂解，提取总蛋白用于L-古洛诺内酯氧化酶ELISA测定。
肝细胞代谢物检测：通过收集用胆红素处理的HLO的上清液和大鼠的血清，用胆红素检测试剂盒测定胆红素；收集HLO，接种到96孔测定板中，用细胞抗氧化检测试剂盒测定细胞抗氧化水平、氮相关代谢物(用谷胱甘肽、氨、尿素、谷氨酰胺、葡萄糖和甘油三酯测定试剂盒)测定。
代谢活性检测：通过收集HLOs，将接种到96孔板中，进行细胞色素P450酶家族中的CYP3A4和CYP1A2药物代谢酶检测、细胞培养上清中人类Notch1信号通路报告基因检测、氮代谢相关酶（谷氨酰胺合成酶、谷胱甘肽S转移酶、脂肪酶和葡萄糖激酶）活性检测。裂解HLO，用Caspase-3比色检测试剂盒进行细胞凋亡检测。
带状毒性测定(Zonaltoxicityassay)：HLOs的烯丙醇、3区乙酰氨基酚毒性、mZ-HLO再生潜力测试，用细胞裂解物测试Caspase3活性。用CellTiter-Glo荧光细胞活力测定检测活细胞数量。
基因表达分析：
对不同分区细胞功能基因表达的RT-qPCR检测中，Dox诱导的Z1-HLO中ACSS2、ASL、CPS1和OTC基因的表达水平上调，抗坏血酸诱导促进了Z1-HLO中CPS1+门周区肝细胞分化。
RNA-seq是一种高通量测序技术，能对单个细胞、特定功能状态下包括mRNA、rRNA、 tRNA、microRNA及其他各种非编码 RNA(ncRNA)在内所有转录产物进行定量分析。通过对测序数据进行分析，可以获得特定样品基因表达研究和转录层面全面信息。RNA-seq分析表明，A1AT、HNF4A 和 CEBPA 等泛肝细胞标志基因在 Z1 和 Z3-HLO 中均一致表达。Z3-HLO中GHR、BCHE和 RCAN1等中央静脉区特异性基因表达水平高，而 Z1-HLO则表达ACSS2、SLBP和 RND3。
ChiP-reChIP、ChiP-qPCR和ChIP-seq分析
染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是一种用于研究体内蛋白质与DNA相互结合的方法。通常先用甲醛处理活细胞固定DNA-蛋白质复合物，再用工具酶将染色质切成无数个染色质小片段，基于抗原-抗体特异性结合原理，用抗体将含有目标蛋白的染色质片段提取富集后，再将结合的蛋白质、DNA解离以获得纯化DNA片段。ChIP与PCR、qPCR联用，可确认DNA序列与特定蛋白间的结合。将ChIP与NGS测序结合（ChIP-Seq技术），对富集到的全部DNA片段进行测序，可在全基因组范围内检测与特定组蛋白、转录因子等结合的潜在DNA位点。ChiP技术可从研究单一目标蛋白与已知靶序列间的结合，发展到单一目标蛋白与整个基因组内未知序列的相互作用、两种或多种蛋白复合物与单一DNA序列的相互作用（即ChIP-reChIP方法，是将第一轮ChIP富集到的蛋白-DNA复合物继续进行第二种蛋白的免疫沉淀，从而得到与同一个DNA序列结合的两种不同蛋白）。
通过组蛋白特异性抗体，将带有特定修饰的组蛋白-DNA复合物沉淀，获取的组蛋白可确定组蛋白修饰相关的DNA特定位点和组蛋白修饰酶靶标。因此，ChiP技术是表观遗传学中检测转录因子与特定基因启动子相互作用，组蛋白乙酰化与染色质的开放和转录调控的重要方法。
ChIP-seq 分析显示，组蛋白乙酰转移酶EP300与mZ-HLO中的7875 个结合位点的结合增加，可乙酰化增强子区并激活转录，导致肝母细胞分化和干细胞分区差异化转录。
单细胞核转录组测序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）分析
细胞核RNA中含有大量的非编码序列，其中包含基因间区序列和的内含子序列。snRNA-seq分析用于单个细胞水平的细胞核RNA检测，较好地保持了细胞原始状态和特性，适用于研究细胞表型鉴定。将snRNA-seq和细胞轨迹分析结合，用 snRNAseq 数据集表征不同的肝细胞身份，阐明细胞功能相关基因集。而根据基因的表达状况把样本分为多个分化状态下的细胞群，生成细胞谱系发育树，可用于预测细胞的分化及发育轨迹。
snRNA-seq分析显示，与原代肝细胞snRNAseq数据集相比， mZ-HLO中的实质细胞群体（除肝母细胞群体）分区与肝细胞群体高度一致。轨迹分析揭示肝脏分区源于肝母细胞，肝脏再生过程中，2区肝细胞各分区肝细胞的主要来源。
3.3多区肝脏类器官实验报告信息与欧盟MIAOU标准的对比
我们按欧盟MIAOU标准要求，将《用人多能干细胞生成的多区肝脏类器官》可利用的全部信息生成了包含5方面内容的多区肝脏类器官实验元素据报告表。
欧盟MIAOU标准要求的元数据信息 | Nature多区肝脏类器官实验报告信息 |
Section 1. Identification Of The Project | |
Project Title | XX |
Acronym Of The Project (if any) | - |
Type of Organoid | |
Organoid for Basic Research | 是 |
Factoroid (Organoid for Bioproduction) | 否 |
Organoid or Preclinical Research | 否 |
Organoid for Clinical Use | 否 |
Others (If Yes, Specify) | - |
Name of The Organoid | 人多分区肝脏类器官 |
Purpose of The Project | 作为人类肝脏体外细胞模型用于与肝脏发育和疾病相关的基础研究 |
Section 2. Source Material | |
Does your research involve human material? | 是 |
If YES： | |
Is the material obtained from volunteers? | 是 |
Has informed consent been obtained? | 是 |
Provide details of the informed consent: | N.A. |
Is the volunteer a patient? | 是 |
Is the genetic identity at arrival known? | 是 |
If starting material is obtained from a biopsy, are descriptors known (gender, age, anatomical regions, diagnosis, viral status, etc.)? | 是 |
Please list items. | 性别: 男性 年龄: N.A. 取材所属解剖区域：包皮环切术后废弃包皮组织 患者病情临床诊断：N.A. 病毒感染状态：N.A. |
Does the sponsor of the research hold clinical data on the patient? | 是 |
Is the laboratory authorised to prepare and conserve human body elements for scientific purposes? | 是 |
Give details and references of the collection declaration. | N.A. |
Is the starting material a cell line? | 否 |
If YES： | |
Is the genetic identity at arrival known? | 是 |
Please specify (DNA sequence, SNPs, PCR, STR, CGH array, etc.) | 京都大学赠送的1383D6和RCL-BC iPSC：N.A. 患者包皮成纤维细胞诱导的72.3 和 72.3-GFP iPSCs：N.A. |
Is there genetic quality control (karyotype, STR, PCR, etc.)? | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell line functionally validated (differentiation test for pluripotency of iPSC, permeability test for epithelial cell, etc.)? | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell identity validated after X passages? | N.A. |
Specify X. | N.A. |
Are cell type markers identified (example: marker name, detection method, target value)? | N.A. |
Please list. | / |
Is the number of passages at arrival known. | N.A. |
Is the number of possible, or required, passages before the genesis of organoids defined? | / |
Are the storage conditions known? | 是 |
Please describe preservation protocol (culture, freezing, thawing protocol, storage modalities) | 见原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Does the material contain mutations (genetic disease)? | N.A. |
Is the sanitary status known? | N.A. |
Please give details of tests (mycoplasma, bacteriological, fungal, etc.) | N.A. |
Is the starting material primary cells from patients? | 是 |
If YES： | |
Is the genetic identity at arrival known? | 是 |
Please specify (DNA sequence, SNPs, PCR, STR, CGH array, etc.) | N.A. |
Is there genetic quality control (karyotype, STR, PCR, etc.)? | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell line functionally validated (differentiation test for pluripotency of IPSC, permeability tests for epithelial cell, etc.). | N.A. |
Please describe. | / |
Is the cell identity validated after X passages? | N.A. |
Specify X. | / |
Are cell type markers identified (e.g. marker name, detection method, target value)? | N.A. |
Please list. | / |
Is the number of passages at arrival known? | 原代 |
Is the number of possible, or required, passages before the genesis of organoids known? | 原代 |
Are the storage conditions known? | 是 |
Please describe preservation protocol (culture, freezing, thawing protocol, storage modalities). | 见原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Does the material contain mutations (genetic disease)? | N.A. |
Is the sanitary status known? | N.A. |
Please give details of tests (mycoplasma, bacteriological, fungal, etc.) | N.A. |
Are the cell culture conditions precisely described? | 是 |
If YES： | |
Are the culture conditions well defined? | CO2培养箱工作参数：37℃、5% CO2和95%空气 |
Provide details of culture conditions (composition of culture media, nature, origin and quantities of supplements used - e.g. glucose, serum, antibiotics, growth factors etc.) | 见原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Are the nature and treatment of the substrates well described? | 是 |
Are the seeding conditions well described? | 是 |
Is the frequency of media changes defined? | 是 |
Are O2/CO2 concentrations given? | 是 |
Provide details of the culture conditions | CO2培养箱工作参数：37℃、5% CO2和95%空气 |
What are the storage conditions for the lines or cells? | -80℃超低温保存 |
Are there cell master banks? | N.A |
Describe protocols and drift control. | N.A. |
Are there cell working banks? | 是 |
Describe protocols and drift control. | N.A. |
Are storage conditions indicated? | 见原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Describe the freezing and thawing protocol. | N.A |
Are the storage modalities given? | 见原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Please specify. | 同上 |
Section 3. Manufacturing of The Organoid | |
Does the project include 2D differentiation? | 是 |
If YES： | |
Provide details on culture media, nature, origin, supplements used (e.g. growth factors glucose, serum, antibiotics, CO2/O2 concentrations, etc.) | 见原文[Method]“mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance” |
Describe the sequence and duration of differentiation treatments. | 同上 |
Are the culture substrates treated? | 同上 |
Describe the seeding conditions and frequency of media changes | 同上 |
Is there quality control for the differentiation process? | 同上 |
Provide details (e.g. morphology, material homogeneity, max and min confluence, proliferation, functional test, monitoring of markers, possible sorting, mortality rate). | 形态学：N.A.;材料均匀性：N.A;最大和最小汇合：N.A. 细胞增殖：N.A. 功能测试：N.A.;标记物监测：N.A. 细胞的分类：N.A.;细胞死亡率：N.A. |
Does the project include the generation of (3D) organoids? General considerations | 是 |
If YES： | |
Provide details on culture media, nature, origin, supplements used (e.g. growth factors glucose, serum, antibiotics, CO2/O2 concentrations, etc.). | 见原文[Method]“Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Describe the sequence and duration of differentiation treatments | 同上 |
Are the culture substrates treated? | 同上 |
Describe the seeding conditions and frequency of media changes. | 同上 |
Is there quality control for the differentiation process? | 同上 |
Provide details (e.g. morphology, material homogeneity, max and min confluence, proliferation, functional test, monitoring of markers, possible sorting, mortality rate). | 形态学：N.A.，材料均匀性：N.A. 最大和最小融合度：N.A.，细胞增殖：N.A. 功能测试：见原文[Method]一节 标记物监测：见原文[Results]“Multi-Zonal Human Liver Organoids via assembly of Z1- and Z3-HLOss” 细胞的分类：见原文[Results]“snRNAseq of mZ-HLOs reveal features of zonal hepatocytes” 细胞死亡率：N.A. |
Does organoid generation make use of matrices? | 是 |
If YES： | |
Describe the nature of the matrix (matrigel, hydrogels, hyaluronic acid, human decellularized matrix, etc.) | 见原文[Method]“Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Give the matrix concentration. | 同上 |
Give details of the preparation method (temperature, polymerization time, drop or layer structure, etc.). | 同上 |
Give the seeding density per matrix volume unit. | 同上 |
Specify the volume and number of drops of matrix per unit area in the culture medium. | 同上 |
Specify the amount of medium depending on the size of the well. | 同上 |
Describe the matrix dissociation method for organoid recovery. | 同上 |
Describe the organoid dissociation method used for their expansion. | 同上 |
Does the culture include multiple cell types? | 是 |
If YES： | |
Describe the sequence for co-culturing and adaptation of the co-culture media. | 见原文[Method]“Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Indicate the proportions of cell types. | 见原文[Results]“snRNAseq of mZ-HLOs reveal features of zonal hepatocytes” |
Section 4. Organoid Characterisation | |
Has a morphological/structural characterisation been performed? | 是 |
If YES： | |
Describe the appearance, size, shape [circularity, tubularity, regularity of contours (budding), etc.]. | 荧光显微镜 BZ-X810成像，用Fiji（v1.53f）对图像进行形态测量和测定 |
Evaluate opacity/ refringency. | N.A. |
Quantify intra and inter-organoid homogeneity. | N.A. |
Give details of expected morphological, architectural and ultrastructural features, and organisation of cell types (identity, proportions, distribution). | 1）形态、结构和超微结构特征：N.A. 2）细胞组成类型、比例：SERPINA1 肝细胞 (55%)、KRT7 胆管细胞(11%)、PECAM1 内皮细胞(12%)、LYZ 巨噬细胞(7%)、COL1A1 星状细胞(7%)和 CD44 间充质细胞(8%) |
Has a molecular characterisation been performed? | 是 |
If YES： | |
Provide elements of genomics, transcriptomics, metabolomics, proteomics. | 转录组学检测元数据：RT-qPCR, RNA-seq, snRNA-seq 表观遗传学检测元数据：ChiP-qPCR、ChIP-seq |
Indicate expected specific molecular markers, epigenetic characteristics. | 特异性分子标记物：见原文Fig. 1g. 表观遗传特征：RNA-seq、ChIP-seq 和 snRNA-seq 数据已存入GEO，登录号GSE222654。 |
Has a functional characterisation been performed? | 是 |
If YES： | |
What are the qualitative and (if possible) quantitative functional characteristics? | 见原文[Method]一节 |
If treatments are applied, detail the treatment protocol, response to treatments (pharmacological, chemical, physical, hormonal, etc.), and evaluation (quantitative or qualitative). | 见原文[Method]“Zonal toxicity assay”、Extended Data Fig. 11. |
Are traceability and organoid drift evaluated? | 是 |
If YES： | |
Describe how the traceability of components is evaluated (batches, suppliers etc., environments, complements). | 见原文[Method] “mGulo iPSC generation and general iPSCs maintenance、Organoid generation、Generating multi-Zonal Human Liver Organoids with zonal diversity” |
Indicate criteria for the traceability of conditioned media (drift of cells used for conditioning, control of lines, such as those at the origin of the organoid) control of at least one of the growth factors). | 同上 |
Describe the qualitative drift criteria (morphological, structural, functional, molecular, etc.) specific to each organoid. Specify indices if applicable. | N.A. |
How is robustness evaluated (same starting cells, same organoid)? Specify indices if applicable. | N.A. |
Section 5. Use Of Organoids | |
Are the organoids designed for basic research? | 是 |
If YES： | |
Is compliance with GLP required for organoid production? | 否 |
Give details, if applicable. | / |
与欧盟MIAOU标准的对照显示，多区肝脏类器官一文所披露的类器官实验元数据并不完善。表中凡标记为N.A.的条目，不查阅作者公开发表的其它类器官研究报告等外部材料情况下，单从该报告是无法获知详情的。
为确保类器官实验起始材料的性状一致性，MIAOU标准的“Section 2材料来源”部分对干细胞材料要求提供接收时干细胞传代（passages）的代数、细胞系分子遗传信息、生物标志物及是否经过干细胞多能性验证的信息。此外，在培养维持干细胞材料时，规定要注明样品经过支原体/细菌学/真菌感染检测阴性的结果。然而在多区肝脏类器官一文中，读者除根据常识可以判断人体材料捐献者系男性，为阴茎包皮环切术废弃组织外，患者年龄、手术时疾病诊断信息、是否有遗传病及病毒感染等MIAOU标准规定信息都无从可考。合作单位惠赠的iPSCs的传代（passages）的代数、细胞系遗传信息、生物标志物等信息及查询途径均未作说明，对细胞培养过程中样品及培养环境是否经支原体/细菌学/真菌感染检测为阴性结果亦无明确备注。
“Section 3 类器官的生成”部分，无论是细胞2D培养、3D培养操作过程，缺少传代操作的时细胞融合度范围区间、细胞计数结果（从活细胞比率可计算出死细胞比率）等重要信息。此外，未对倒置显微镜相差模式下的细胞形态提供必要文字说明，也无超微结构（一般指的是电镜图片）特征信息描述。“Section 4 类器官的表征”工作，只提供了细胞标志物荧光图像资料，缺少对具有质控意义的细胞功能、活力和表观遗传学特征指标的明确说明。
多区肝脏类器官一文研究团队有十余年类器官研究的成功经验。如此雄厚技术实力背景下，报告中出现MIAOU标准中规定的类器官材料元数据要素的缺失，显然绝非实验资源条件受限所致，而应归结为研究团队对类器官实验操作和实验过程质量控制标准化内部要求与欧盟MIAOU标准规范的不一致。这也恰恰反映了当今的欧盟、美国和日本乃至全球科学界，在类器官研究技术标准不统一的现状。
另一方面，通过对照也反映出欧盟MIAOU标准自身的技术局限性。
一是其中部分环节质控标准设置值得商榷。特定的原代细胞、诱导多能性干细胞株，在不同培养维持和诱导条件、多次传代操作过程中，与其说要注意防范基因突变发生的风险，不如重点关注细胞因培养环境改变后细胞表观遗传学特征偏差的可能性。以本文所讨论的研究项目为例，相同遗传背景的肝脏类器官在不同化合物诱导处理后，细胞基因表达表现出明显的空间差异化特征。文中没有提供任何的细胞基因组、关代谢相关功能基因序列或STR测试数据信息。因此，规定所有实验环节所用的细胞材料须提供DNA序列、SNP分析、PCR检测、STR位点等基因序列信息作为质控标准就不尽合理，给研究工作平添额外开支和工作负担。此外，实验前须进行iPSC多能性分化实验或上皮细胞渗透性实验，不仅会消耗部分宝贵的细胞材料资源，还会造成本已耗时冗长的类器官培养时间进一步拉长。因此，MIAOU标准应该仿照实时荧光定量PCR实验报告的MIQE指南，对列出的要素信息按其重要程度实施分级管理，可能更合理和具有可行性。
其二，MIAOU标准，视乎主要是针对常规类器官、类器官芯片而设置的。尽管HYBRIDA项目已将的类器官组装体、嵌合型类器官纳入监管视线，但目前看，并不能完全适应更复杂的类器官组装体操作、表征和质控管理的要求。
这么一说，我们真有点期待欧盟的MIAOU 2.0标准了。
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