中国科大在活细胞深低温冷冻保存方向取得重要进展

       低温保存是通过使用非常低的温度（-80或-196°C）来长期保存器官，组织，细胞和其他生物材料的基本且重要的技术。在冷冻保存温度条件，在活细胞中的化学反应和生物反应显著减少，甚至停止，这是用于实现各种生物样品的长期保存的基本机制。

       冷冻保存的细胞或组织不仅维持从低温解冻后正常结构和功能完整性，也允许进一步的临床应用和基础研究。到目前为止，基础理论，低温设备，冷冻保存策略以及用于冷冻保存的新型冷冻保护剂（CPA）在冷冻生物学领域取得了突破，从而促进了冷冻保存的许多生物医学应用的广泛发展，包括辅助生殖，干细胞疗法，再生医学，组织工程，生物样本库以及药物的开发和研究。例如，基于干细胞医学的最新进展，对干细胞的需求急剧增加。因此，实现干细胞的高质量和高效存储对于克服当前的供需不平衡至关重要。此外，另一种典型的应用领域是人的生育。最近，由于偶尔的疾病，积极的药物使用和外部压力，年轻女性的不孕风险已经增加。全世界年轻人中发生的生殖疾病严重影响了他们的生育能力。因此，卵细胞，精子，卵子和胚胎的冷冻保存对于人类繁殖至关重要。总之，对于各种生物样品（例如，细胞，组织，器官和疫苗）而言，首要且必不可少的冷冻保存科学对于生物医学工程领域的临床应用和科学研究至关重要。

       冷冻保存期间的冰损伤

       作为保存生物标本的基本和重要方法，冷冻保存可以有效地减少新陈代谢，并为各种生物学应用提供重要支持。图 A总结了在冷却和加热过程中发生的基本低温保存程序和低温伤害。值得注意的是，在冷冻保存的融化过程中，冰晶的形成和生长是导致细胞活力丧失的主要问题。冰晶在整个低温保存过程中是不可避免的，其控制和抑制对于最大限度地减少细胞损伤至关重要。

       通常，在冻融循环过程中，冰损伤可分为细胞外和细胞内冰。它公知的是低温细胞的存活在很大程度上取决于冷却速率，，其可以被定义为缓慢冷冻和玻璃化（图 B）。如图C所示 ，根据拖曳因子假设理论，关于缓慢冷冻，大多数细胞内水流出是因为细胞内水的化学势高于细胞外冰相的化学势，这导致细胞脱水，并因此引起细胞外冰和渗透压损害。随着冷却速率的增加，细胞内的水不能迅速流出，从而形成细胞内的冰并在冷冻过程中导致对细胞的致命性冷冻伤。无论缓慢或快速冷冻，冰晶的形成都是不可避免的，在冷却过程中优化细胞外和细胞内的冰晶并最大程度地减少对细胞的冰害至关重要。尤其，玻璃化冷冻保存可以避免冷冻过程中的冰损伤，这是由于在高浓度的CPA的帮助下溶液的无冰状态。然而，在解冻阶段发生的失透和重结晶可能对冷冻保存的细胞造成致命的损害。此外，高浓度CPA的毒性也是玻璃化冷冻保存策略的主要问题和局限。总之，冰成核的形成，冰晶的生长以及冰的再结晶/失透是限制冷冻保存效率和质量的三个主要因素（图 高浓度CPA的毒性也是玻璃化冷冻保存策略的主要问题和局限性。总之，冰成核的形成，冰晶的生长以及冰的再结晶/失透是限制冷冻保存效率和质量的三个主要因素（图 高浓度CPA的毒性也是玻璃化冷冻保存策略的主要问题和局限性。总之，冰成核的形成，冰晶的生长以及冰的再结晶/失透是限制冷冻保存效率和质量的三个主要因素（图 D）。

       近日，中国科学技术大学电子科学与技术系赵刚课题组和马里兰大学何晓明课题组合作，利用低浓度的海藻糖这一单一的低温保护剂实现了细胞的高效低温保存。

       传统的细胞低温冷冻保存方法通常需要使用渗透性的、有毒的有机溶剂（例如二甲基亚砜、甘油等）作为低温保护剂，复温后的细胞必须经过繁琐的洗涤过程去除细胞内外的有机溶剂才能实际应用。而海藻糖是一种天然的二糖，广泛存在自然界多种微生物中，相对于传统的低温保护剂而言，具有无毒高效的低温保护效果。已有研究表明，海藻糖必须同时存在于细胞膜内外两侧时，其保护效果才最佳。然而，哺乳动物细胞自身不能合成海藻糖，且其细胞膜上没有海藻糖转运蛋白，这就导致海藻糖无法高效、无损地进入细胞内部，严重限制了海藻糖在细胞低温冷冻保存中的应用。

       面对这一挑战，中国科学技术大学赵刚课题组和马里兰大学何晓明课题组合作，创造性地设计了一种冷响应的纳米胶囊，用于海藻糖的纳米尺度封装、细胞内递送和温度控制释放。且使用该方法成功实现了两种典型细胞的低温冷冻保存，其保存效果与传统的二甲基亚砜相当，却完全避免了伴随传统低温保护剂的复温后的繁琐的、损伤性的细胞洗涤过程。

研究人员基于水热法成功将聚乙烯吡咯烷酮与二硒化钨复合，通过调控合成参数，制备出纳米片和纳米花形态的纳米复合材料。基于功能材料与外部物理场的协同作用，这种纳米复合材料集成了抑制冰晶的形成、生长以及快速消融的一体化功能，因此可以显著降低细胞低温保存过程的冰晶损伤，极大的提高细胞保存效率。

       基于该纳米复合材料的协同冰晶抑制效应，研究结果表明：1）降温过程中纳米材料具有可以调控冰晶成核的作用，显著降低溶液过冷度，从而可以显著降低样品在降温过程遭受的冰晶损伤。2）基于吸附-抑制效应，发现该种纳米复合材料可以选择性的吸附至冰晶界面处，从而抑制复温过程中的冰晶再结晶；同时基于纳米材料的光热转换效应，可以实现冰晶的快速消融，促使生物样品快速穿过危险温区，降低复温过程遭受的低温损伤。3）基于冰晶协同抑制效应，实现了活细胞构建物在低浓度保护剂（2 M）下的快速冷冻保存，具有与商用二甲基亚砜（10%）同等的保存效果，并且保存样品可以在体内连续存活多天并且保持正常的增长增殖，表明该种保存方式的可靠性与稳定性，有望为后续的细胞治疗提供了全新的保存方式。