中国科大提出高效低毒抗菌纳米酶的构建策略

       纳米酶是一类具有酶一样高效催化性能的无机纳米颗粒。其中，可以模拟氧化酶、过氧化酶等原位催化生成活性氧物种的纳米酶，被认为是一类具有广阔应用前景的新型抗菌剂。由于活性氧物种能通过氧化作用同时破坏多种对细菌细胞正常生理活动至关重要的生命物质（如核酸，蛋白，脂质），纳米酶被认为能高效清除抗药性细菌，并能延缓细菌抗药性的出现。由于活性氧物种无法区分细菌和哺乳动物细胞，纳米酶失去了理想抗菌剂所必需的选择性。
       中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家研究中心、化学与材料科学学院的阳丽华课题组与熊宇杰团队合作，提出了构建高效低毒抗菌纳米酶的新策略:表面结合的活性氧产生用于选择性抗菌作用的纳米酶。

       为了检验这一策略是否成立团队首先设计了一系列银钯合金（AgPd）纳米笼，并从中筛选出了能高效地原位催化生成表面吸附态活性氧物种的AgPd0.38纳米笼作为模型纳米酶。
       Ag纳米颗粒，Ag纳米立方体和AgPd纳米笼的制备
       通过使用柠檬酸盐作为表面活性剂和抗坏血酸作为还原剂来合成Ag纳米颗粒。在100 mL烧瓶中，通过缓慢加入0.1 mol / L NaOH溶液，将40.0 mL含有柠檬酸三钠（3.0×10 -3 M）和抗坏血酸（6.0×10 -4 M）的水溶液调节至pH值11 。在35℃水浴中，以1000rpm的搅拌速度将0.4mL的AgNO 3水溶液（0.1M）加入到烧瓶中。反应溶液的颜色立即从无色变为深棕色。15分钟后，通过流动冷水几分钟终止反应。最后，将Ag纳米颗粒离心（850× g， 10分钟）。并用去离子水洗涤几次，以去除多余的表面活性剂和杂质。
       Ag纳米立方体是通过以下步骤合成的，将20 mL乙二醇（EG）添加到50 mL圆底烧瓶中，并在油浴中磁力搅拌下加热至150°C，持续1小时。首先将硫化氢钠（NaHS）（3 mM，0.24 mL）注入加热的溶液中，4分钟后，加入HCl溶液（3.5 mM，2 mL），然后加入聚（乙烯基吡咯烷酮）（PVP，20 mg / mL，5 mL，MW = 55,000）。再过2分钟后，三氟乙酸银（CF 3将282 mM，1.6 mL COOAg快速加入混合物中。所有试剂均在乙二醇中新鲜制备。通过改变反应时间并监测紫外可见分光光度计测量的LSPR峰位置，可以很好地控制Ag纳米立方体的边缘长度。一段时间后，将溶液浸泡在冰水浴中淬灭，而无需停止搅拌。最后，收集得到的样品，并用乙醇和去离子水通过离心几次纯化，然后再分散在去离子水中以进一步使用。
       AgPd纳米笼是通过Ag纳米立方体与氯钯钾（K 2 PdCl 4）之间的电流置换反应过程合成的。在磁力搅拌下，在与回流冷凝器连接的50 mL圆底烧瓶中，将含有200 mg PVP的去离子水（20 mL）加热至90°C。银纳米立方体的水溶液（1毫克/毫升，0.5毫升）加入到烧瓶中并10分钟后，K 2的PdCl 4（0.5毫摩尔）缓慢地通过使用投进以0.4mL /分钟的速率将溶液注射泵。AgPd中空纳米结构的不同摩尔比与K 2 PdCl 4的体积和浓度有关，以及下降率。将烧瓶置于冰水浴中终止反应，并在整个过程中保持搅拌。固体氯化钾将少量洒入该溶液直至氯化银溶解和有Cl的过饱和去除- ，这将有助于得到纳米笼的定义良好的中空结构。通过离心将所得溶液用去离子水洗涤五次，然后再分散在去离子水中以进一步使用。

       为了检查纳米颗粒的形态，将一滴纳米颗粒的水悬浮液添加到一块碳包铜板上，在环境条件下干燥，然后在透射电子显微镜（TEM）上观察（Hitachi H-7700操作在100 kV下工作，而JEOL JEM-2100F在200 kV下工作以进行EDS映射和HRTEM）。
       为了测量纳米粒子的元素组成，将纳米粒子用王水溶解（HCl / HNO 3  = 3：1，体积比），然后用感应耦合等离子体质谱法（ICP）对所得溶液进行金属含量定量分析-MS）
       为了确认纳米颗粒的结构，通过X射线粉末衍射（XRD）进一步表征纳米颗粒。
       为了监测纳米颗粒的尺寸和表面Zeta电位，将纳米颗粒分散到Millipore水中至最终浓度为10μg/ mL，然后使用纳米颗粒分析仪（Nano ZS90，Malvern）对所得分散体进行动态光散射测量）。在72小时内监测1×PBS或Mueller-Hinton（MH）肉汤中纳米颗粒的胶体稳定性。
       体外抗菌实验结果显示AgPd0.38纳米笼能借助于其表面原位生成的活性氧物种，实现对细菌包括抗药性细菌的高效清除（在4-16ug/mL即可实现99.9%的细菌杀灭效率），且经多次反复使用也未见导致细菌抗药性出现。与此同时，体外细胞毒性实验结果显示AgPd0.38纳米笼对多种哺乳动物细胞均无毒性。进一步地，小鼠伤口感染模型实验结果显示，AgPd0.38纳米笼的这种高效低毒抗菌性质在复杂的生理环境中仍然有效。

       这项工作首次提出了一种高效低毒抗菌纳米酶的构建策略，有望促进生物相容性纳米酶的应用研究并有助于应对细菌抗药性危机。