北京大学第二代微型化双光子显微镜问世

目前，各国脑科学计划的一个核心方向就是打造用于全景式解析脑连接图谱和功能动态图谱的研究工具。其中，如何打破尺度壁垒，融合微观神经元和神经突触活动与大脑整体的信息处理和个体行为信息，是脑科学领域内亟待解决的一个关键挑战。

在国家自然科学基金委重大科研仪器研制专项《超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统》的支持下，由北京大学分子医学研究所联合北大信息科学技术学院电子学系、工学院以及中国人民解放军军事医学科学院等组成的跨学科团队，在Nature Methods 发表[Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane, and long-term brain imaging]。这是继2017年第一代新型微型化双光子显微镜FHIRM-TPM之后的又一重大突破。

FHIRM-TPM 2.0成像视野扩大至420×420平方微米，微型物镜的工作距离扩展至1毫米，以实现非侵入式成像；嵌入了可拆卸的快速轴向扫描模块，实现了180微米深度的三维体成像和多平面快速切换的实时成像。该模块由一个快速的电动变焦透镜和一对中继透镜组成，在不同深度成像时保持放大倍率恒定。其中，变焦模块重量1.8克，研究人员可根据实验需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探头还可整体即时拔插，极大地简化了实验操作，避免了长周期实验时对动物的干扰。在重复装卸探头跟踪同一批神经元时，视场旋转角小于0.07弧度，边界偏差小于35微米。

一、FHIRM-TPM 2.0系统的设计，低倍率大FOV物镜的头架和性能测试。

带插图的显微镜设计，显示了FHIRM-TPM 2.0头盔的轮廓。ETL：电子可调镜头；HC-920：空心光子晶体光纤，可传输920 nm飞秒激光脉冲；HWP：半波片；MEMS：微机电系统；PMT：光电倍增管；SFB：柔软的纤维束。

ZEMAX模拟头戴式耳机中的光学组件。图c，视场 MEMS的扫描角度为±4.5°，焦平面中的扫描FOV为〜420 µm×420 µm（xy）。图d，通过改变ETL的屈光度来改变焦平面。ETL的扫描范围为±30屈光度，相应的聚焦范围为〜±90 µm（z）。

图e，物镜的照片（3x，NA 0.5）。图F，FOV和失真测试使用100 µm网格标准进行。虚线正方形勾勒出与MEMS扫描场相对应的420μm×420μm区域。图g，使用标准USAF1951分辨率测试目标进行空间分辨率测试。光源是中心波长为940 nm的光纤耦合LED。图h，沿g所示的交叉线的强度分布。

 二、 FHIRM-TPM安装和拆卸设计。

  图a底板（顶部）和支架（底部）的示意图。b，示意图说明头戴装置安装在基板组件上，以及固定在慢性颅窗玻璃盖玻片上的支架。

安装，拆卸和重新安装耳机。步骤1，将带有盖玻片的基板用牙胶固定在颅窗上。步骤2，放置头戴式耳机。首先将头戴螺丝固定在其支架上，然后使用三轴电动平台将其放置在底板上。一旦找到感兴趣的区域，就用牙科用胶粘剂将支架固定到基板上。步骤3，通过旋松并从固定器上拔下耳机来进行拆卸。步骤4，要重新安装，在底板的盖玻片上放一滴水；然后，将耳机插入并用螺丝固定到支架上。

 三、ETL的性能测试。

1. 测试系统示意图。ND，中性密度；ETL，电子可调镜头；PD，光电探测器。b，使用放置在ETL下方一定距离（h）的PD耦合光纤进行ETL屈光度测量的原理。对于准直的入射光束，蓝线表示ETL正屈光度处的会聚出射光束，绿线表示负屈光度处的发散出射光束。

图片显示了清醒的状态下表达GCaMP6s的小鼠的额叶皮层和树突的树突和棘,比例尺为30μm（左）和5μm（右）

 FHIRM-TPM 2.0扩大了微型双光子显微镜的适用性和实用性，使神经科学家能够更自由地探索更多新的行为范式，可用于在动物觅食、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，长时程观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化。如学习和记忆，社会互动和恐惧条件反射，甚至是慢性疾病的进展和老化，如神经发生和再生，疾病进展和衰老，以破译大脑的奥秘。

论文链接 ： https://www.nature.com/articles/s41592-020-01024-z